如果將細胞連續培養在同一個容器中，培養密度會逐漸增大，造成細胞衰老、細胞死亡。為了防止這種情況，將少量細胞移植到單獨的容器中，這個過程稱為“傳代”。

傳代程序根據細胞的性質而略有不同，因此請務必檢查適合您所處理的細胞的方法。在本文中，我們將解釋三種細胞的傳代程序：貼壁細胞和懸浮細胞。

貼壁細胞傳代

貼壁細胞在體外生長，直到培養容器表面被細胞覆蓋或培養基中的營養物質耗盡。最好在細胞生長達到完全匯合之前進行傳代。

所需設備和試劑：

1.預熱至37°C的完全培養基

2.70%乙醇

3.不含鈣鎂離子的PBS(-)

4.0.25%胰蛋白酶溶液（含或不含EDTA）

5.胰蛋白酶抑制劑（可選）

6.臺盼藍

7.培養皿/培養瓶和標簽

8.倒置顯微鏡

9.離心機（可選，用于收集細胞）

10.血細胞計數器

11.移液器

貼壁細胞傳代方法：

以下是以0.25%胰蛋白酶為例的貼壁細胞傳代步驟：

1.觀察細胞狀態：使用倒置顯微鏡觀察細胞形態和匯合度。

2.移除舊培養基：小心吸出培養皿或培養瓶中的培養基。

3.清洗細胞：用不含鈣鎂離子的PBS(-)清洗細胞，去除殘留的血清，以避免抑制胰蛋白酶活性。（根據細胞類型，此步驟可省略）

4.加入胰蛋白酶溶液：加入適量的0.25%胰蛋白酶溶液（含或不含EDTA，根據細胞類型決定），確保覆蓋細胞表面。

5.消化細胞：將培養容器置于37°C孵育器中消化，根據細胞類型調整消化時間，通常為1-5分鐘，并密切觀察細胞形態變化，當細胞變圓并開始脫離瓶底時即可終止消化。

6.終止消化：加入含有血清的完全培養基或胰蛋白酶抑制劑終止胰蛋白酶的消化作用。

7.制備細胞懸液：用吸管輕輕吹打細胞，使細胞完全脫離瓶底并形成均勻的細胞懸液。

8.計數細胞：使用血細胞計數器和臺盼藍染色進行細胞計數和活力檢測。

9.稀釋和接種：根據所需的細胞密度，用新鮮的完全培養基稀釋細胞懸液，并將細胞懸液接種到新的培養容器中。

10.培養細胞：將新的培養容器放入37°C、5%CO2的孵育器中進行培養。

貼壁細胞傳代技巧

執行此操作時需要記住幾點。首先，根據生長階段，某些細胞系可能與表面的附著較弱，容易脫落。經常檢查培養容器內部的狀況，注意不要過早地分離細胞。

在步驟3中，用PBS(-)沖洗細胞表面，去除培養基中的血清。這很重要，因為胰蛋白酶在血清存在下不活躍。

當使用胰蛋白酶/EDTA對細胞進行處理時，請以分離細胞所需的最短時間進行處理。長時間接觸可能會損害細胞表面受體。還可以使用非酶細胞分離劑（例如胰蛋白酶）來分離細胞。建議根據需要使用，例如當您想在溫和的條件下剝皮時。

當將細胞接種到新的培養容器中時，必須用血清中和胰蛋白酶以使細胞粘附。除了使用血清外，還可以使用胰蛋白酶抑制劑（例如來自大豆的抑制劑）來中和胰蛋白酶。在這種情況下，首先向要中和的懸浮液中添加等體積的胰蛋白酶抑制劑（濃度為1mg/mL）。然后將添加的溶液離心，棄去上清液，并將細胞重新懸浮在新鮮培養基中。此程序在無血清培養基中培養時特別有效。

如果沒有二氧化碳培養箱，則用經過0.2μm過濾器消毒的空氣中的5%二氧化碳交換氣體1-2分鐘。

如果細胞密度不夠，則以150×g離心5分鐘，并用少量培養基重新懸浮。

懸浮細胞傳代

懸浮細胞通常來源于血細胞或可以在培養基中懸浮生長的細胞。它們可以以單細胞或細胞團塊的形式生長。懸浮細胞的傳代通常比貼壁細胞更容易。

所需設備和試劑：

1.預熱至37°C的完全培養基

2.70%乙醇（用于消毒）

3.臺盼藍

4.培養瓶和標簽

5.倒置顯微鏡

6.吸管

7.血細胞計數器

8.離心機(如果需要分散細胞)

9.條件培養基(可選):

條件培養基是指培養細胞一段時間后收集的培養上清液，其中可能含有細胞分泌的生長因子和其他活性物質。對于某些細胞系，可以將少量條件培養基(例如10-20%)添加到新鮮培養基中，以促進細胞生長。但是，使用條件培養基需要謹慎，并根據具體細胞類型進行優化。

以下是懸浮細胞傳代的步驟：

1.檢查細胞狀態:在顯微鏡下觀察細胞的形態、密度和活力，并檢查是否存在污染。健康的懸浮細胞通常呈圓形、明亮且具有折光性。

2.分散細胞(如果需要):對于容易結團的細胞，可以將細胞懸液轉移到離心管中，以150xg離心5分鐘。棄去上清液，然后將細胞沉淀重懸于新鮮培養基中，并用吸管輕輕吹打，使細胞分散成單細胞懸液。對于不結團的細胞，此步驟可以省略，直接進行下一步。

3.計數細胞:取少量細胞懸液(100-200μL)，用臺盼藍染色，然后使用血細胞計數器進行細胞計數和活力檢測。

4.稀釋和接種:根據細胞類型和生長速度，計算所需的細胞密度和培養基體積。使用新鮮的預熱完全培養基將細胞懸液稀釋至合適的濃度，然后將細胞懸液接種到新的、已標記的培養容器中。

5.培養細胞:將新的培養容器放入37°C、5%CO2的孵育器中進行培養。

6.定期觀察和傳代:定期觀察細胞生長狀態，根據細胞密度和活力，確定合適的傳代時間和比例。

處理生長過度的細胞:

如果細胞密度過高，培養基顏色發生明顯變化（例如，含酚紅的培養基變黃），或細胞活力下降，則表明細胞可能生長過度。在這種情況下，建議降低接種密度，并更頻繁地更換培養基，而不是簡單地添加條件培養基。對于某些細胞系，可以考慮使用條件培養基來促進細胞的恢復，但需要根據具體情況進行調整。

掌握細胞傳代技術是細胞培養成功的關鍵。本文詳細介紹了貼壁細胞和懸浮細胞傳代的具體步驟、所需材料以及一些實用技巧。雖然我們提供了通用的指導原則，但不同細胞類型在最佳傳代時間、胰酶濃度、接種密度等方面存在差異。因此，在進行細胞傳代操作前，務必查閱相關文獻和細胞系的具體說明書，并根據實際情況進行優化調整。只有在實踐中不斷積累經驗，才能更好地掌握細胞傳代技術，確保細胞的健康生長和實驗的順利進行。希望本指南能夠幫助您在細胞培養的道路上更加得心應手。