ELISA試劑盒具有靈敏度高、特異性好、操作簡便、重復(fù)性好等優(yōu)點，成為科研工作者和臨床醫(yī)生的重要工具。但ELISA操作要具備專業(yè)操作，在實驗前能正確了解ELISA實驗說明書，可以提高實驗的準(zhǔn)確性，避免實驗假陽性發(fā)生。

  

  ELISA試劑盒說明書

  

  ELISA試劑盒組成

  

  現(xiàn)已開發(fā)了多種試劑盒來簡化 ELISA 實驗，并加速、簡化和標(biāo)準(zhǔn)化每種 ELISA 的流程。現(xiàn)已開發(fā)試劑來提升特異性、可重復(fù)性和靈敏性，并最大程度降低成本。但沒有預(yù)制試劑盒來評估某種特殊目的靶標(biāo)時，實驗者可以制備平板和必要的試劑。以下是有關(guān)一個 ELISA 實驗所需的組分的概述。

  

  一、樣品制備

  

  多個樣品類型（如血液、尿液和裂解細(xì)胞）都常規(guī)通過 ELISA 進(jìn)行分析。樣品制備將取決于待解決的特殊問題。在血清中測定分泌蛋白（如細(xì)胞因子）的方法可直接使用，或者在某些情況下，至少需要清除步驟。在光譜的另一端，要檢測翻譯后修飾，這一般需要用含蛋白酶/磷酸酶抑制劑的緩沖液進(jìn)行細(xì)胞裂解。樣品制備會大大地改變實驗和實驗結(jié)果，因此這需要仔細(xì)考慮。

  

  二、緩沖液

  

  一個 ELISA 實驗需要多種緩沖液。這些包括包被、封閉、洗滌、稀釋、捕獲和檢測緩沖液。這些緩沖液的基本配方廣泛提供，但多數(shù)為市售商品，可以節(jié)省時間，并為研究人員提升質(zhì)控：

  

  包被緩沖液 - 這種緩沖液可用來穩(wěn)定某種抗原或抗體，從而促進(jìn)抗原或抗體被吸收到孔的表面。抗原或包被抗體與塑料孔之間的相互作用會產(chǎn)生吸收和固定。這種被動結(jié)合受多種因素影響，包括塑料的表面化學(xué)性質(zhì)、溫度、包被緩沖液的 pH 值、抗原/抗體濃度和時間。常用的包被緩沖液包括磷酸鹽緩沖生理鹽水 (PBS)、碳酸氫鈉或類似緩沖液，但應(yīng)測試和優(yōu)化這些條件。重要的是，包被緩沖液不應(yīng)含有會競爭地結(jié)合抗原或抗體的蛋白。

  

  封閉緩沖液 - 這種緩沖液能防止檢測抗體非特異性地結(jié)合平板表面。這種緩沖液要么含有會封閉結(jié)合位點的蛋白，要么含有會防止結(jié)合的去垢劑。基于蛋白的封閉緩沖液僅在包被步驟之后才可以添加，因為溶液中的蛋白會被吸附到塑料上所有未結(jié)合位點上。像包被分析物或抗體一樣，任何洗滌步驟都不會去除這些非特異性蛋白。封閉緩沖液需要優(yōu)化，才能達(dá)到最大靈敏度和最低背景，并且不應(yīng)含有會干擾檢測抗體的組分。

  

  洗滌緩沖液 - 這些緩沖液在各步驟之間用來去除所有未結(jié)合的物質(zhì)，并需要在使用后完全去除。洗滌次數(shù)、每次洗滌的時長以及緩沖液中的去垢劑含量需要進(jìn)行優(yōu)化。

  

  檢測緩沖液 - 這些緩沖液含有被抗體-酶復(fù)合體催化的所需底物。這些底物多數(shù)對緩沖條件具有靈敏性，因此在考慮新的檢測化學(xué)成份時，必須考慮裂解緩沖液和其他添加物，以減少檢測分子出現(xiàn)非特異性裂解。

  

  三、微孔板

  

  可以用多種微孔板樣式進(jìn)行 ELISA，包括 96 孔微孔測試條、96-、384- 和 1536-孔板。

  

  最常見的平板有平坦孔底，并且由聚苯乙烯制成。平板用多種方式處理，以產(chǎn)生疏水/親水或特異性反應(yīng)部分。

  

  例如，使用蛋白 A 來更特異性地結(jié)合表面。選擇優(yōu)質(zhì)平板和表面包被有利于降低背景，并增強結(jié)合。

  

  檢測化學(xué)成份通常會影響平板顏色選擇：發(fā)色法為透明色，熒光法為黑色，比色法為白色。

  

  四、ELISA 抗體

  

  為 ELISA 選擇的抗體應(yīng)仔細(xì)選擇，并驗證使用。根據(jù)所選抗體能否高度特異性地結(jié)合目的抗原，可預(yù)測實驗是否成功和結(jié)果是否可靠。除了特異性，選擇的抗體還應(yīng)對抗原具有較高的親和力和親合力。換言之，抗體應(yīng)結(jié)合在一種物種的一個抗原上的表位（特異性），這種結(jié)合應(yīng)快速而有力（親和力），并且一旦結(jié)合，抗體-抗原復(fù)合體應(yīng)穩(wěn)定（親合力）。

  

  為夾心檢測選擇的抗體更復(fù)雜，因為每種抗體需要定向一個不同的表位。根據(jù)實驗需要，夾心檢測的 2 種抗體可以來源于不同物種或相同物種。

  

  在 ELISA 中可使用單克隆抗體和多克隆抗體，但兩者都能提供某些有利于實驗者的優(yōu)勢。

  

  在 ELISA 中使用單克隆抗體或多克隆抗體的優(yōu)勢

  

  單克隆抗體：

  

  對一個表位有特異性，因此它們不會干擾其他抗體結(jié)合抗原的其他區(qū)域

  

  不太可能非特異性地結(jié)合其他抗原

  

  可用于一個 ELISA 的所有步驟

  

  作為非競爭性抗體匹配對的一部分，對夾心 ELISA 尤其有用

  

  多克隆抗體：

  

  可檢測同一抗原上不同表位的抗體并集

  

  可能會檢測一個靶蛋白上的多個結(jié)合位點，因此可提供更穩(wěn)定的信號

  

  對于需要用某種酶（如 HRP 或 AP）標(biāo)記的抗體，標(biāo)記效率、批間變化和偶聯(lián)后的一致性結(jié)合都是設(shè)計一個高質(zhì)量實驗需要處理的問題。

  

  五、ELISA 對照

  

  對照對確保每份樣品產(chǎn)生的信號在生理學(xué)上都是準(zhǔn)確的非常重要。可以合并使用一組對照來驗證一個 ELISA 實驗的有效性。有如下對照：

  

  空白對照可用來提供背景信號參考，并確保讀取值表示樣品中的分析物濃度，而不是實驗設(shè)置的人為結(jié)果。

  

  陽性和陰性對照可用來比較分析物產(chǎn)生的信號。

  

  加標(biāo)對照可用來給出有關(guān)某種特殊樣品基質(zhì)中分析物發(fā)現(xiàn)程度的信息，從而表明檢測性能。

  

  六、微孔讀板機

  

  所選擇的微孔讀板機應(yīng)匹配 ELISA 中使用的檢測類型。比色反應(yīng)的靈敏度最低，其次是化學(xué)發(fā)光和熒光反應(yīng)。使用的檢測類型應(yīng)根據(jù)樣品分析物數(shù)量以及是否需要放大和/或多重分析來決定。重要的是，用特定微孔讀板機檢測的動態(tài)范圍和靈敏度應(yīng)該還會影響檢測方法的選擇。

  

  Elisa試劑盒方法類型

  

  Elisa試劑盒方法分為競爭elisa法、夾心法elisa、直接elisa法和間接elisa法等。

4種elisa法介紹

  

  一、直接 ELISA法

  

  直接 ELISA 技術(shù)涉及將抗原固定在聚苯乙烯微孔板上，然后使用蛋白質(zhì)（例如抑肽酶、卵清蛋白、BSA 或任何其他動物蛋白）封閉微孔板。然后，洗滌板并與一抗一起孵育。

  

  在此測定中，一抗直接與底物（例如 HRP 或 AP）結(jié)合，導(dǎo)致顏色變化。由于過程中只涉及較少的步驟，直接 ELISA 是一種適用于實驗室工作流程的快速技術(shù)，同時還消除了二抗交叉反應(yīng)。但其缺點是反應(yīng)靈敏度低、成本低。

直接ELISA法

  

  二、間接 ELISA法

  

  該技術(shù)的步驟與直接 ELISA 類似。唯一的區(qū)別是涉及額外的洗滌步驟以及該過程中使用的抗體類型。

  

  間接 ELISA工作流程中 涉及兩種類型的抗體：一抗和二抗。

  

  首先添加一抗并洗滌，然后與標(biāo)記的二抗一起孵育。

  

  間接 ELISA 的優(yōu)點是成本較低、更加靈敏和靈活。然而，由于二抗的存在，檢測過程中存在交叉反應(yīng)的可能性。

  

  三、夾心ELISA法

  

  在此測定中，抗原夾在兩種抗體之間。這就是該測定被稱為夾心 ELISA 的原因。該測定首先使用捕獲抗體包被微孔板表面，用 BSA 封閉表面，然后向微孔板中添加抗原，持續(xù)約 90 分鐘。

  

  孵育步驟后，用緩沖液清洗板，然后與標(biāo)記的二抗一起孵育。然后，添加底物來研究和測量反應(yīng)信號。

  

  盡管夾心 ELISA 具有最高的靈敏度，但其主要缺點是該過程所需的時間和費用。此外，尋找完美抗原抗體對的必要性也是該測定的限制。

夾心elisa法

  

  四、競爭性 ELISA

  

  該測定檢測測試樣品中抗原特異性抗體的存在。它涉及使用兩種抗體：樣品中存在的抗體和酶聯(lián)抗體。它們在反應(yīng)過程中競爭抗原。沒有顏色代表陽性測試結(jié)果，而有顏色則代表陰性測試結(jié)果。

  

  該測定法不能用于經(jīng)過任何程度稀釋的樣品，并且靈敏度較低。然而，它有許多優(yōu)點，例如需要較少的樣品純化、較小的變異性以及分析樣品中的一系列抗原。

  

  Elisa試劑盒步驟

  

  雖然不同類型 ELISA 的實驗方案有所不同，但應(yīng)考慮大多數(shù)檢測中常見的步驟如下：

elisa流程圖

  

  板材涂層

  

  大多數(shù) ELISA 的第一步是將檢測的第一個組分與測試板結(jié)合。這通常是通過被動吸附來完成的，這是一個非特異性過程，因此結(jié)果將取決于施加到板上的內(nèi)容。如果應(yīng)用含有抗原的樣品，則結(jié)果是仍然需要選擇性步驟的板，因為將結(jié)合各種抗原，而不僅僅是感興趣的抗原。然而，如果應(yīng)用純化的抗原（如用于抗體檢測的間接 ELISA 的情況）或捕獲抗體（如夾心 ELISA 的情況），那么結(jié)果就是一塊已經(jīng)具有選擇性特性的板。

  

  根據(jù)檢測的目標(biāo)和性質(zhì)，可以使用多種板類型，其中大多數(shù)是聚苯乙烯或聚苯乙烯衍生物，具有不同的結(jié)合特性。一些目標(biāo)，包括高度糖基化的蛋白質(zhì)、碳水化合物、DNA、脂質(zhì)、短肽和蛋白質(zhì)，在去垢劑存在下，不能很好地吸附。在這些情況下，建議使用經(jīng)過處理以允許與表面共價連接的板。

  

  孵化

  

  將試劑添加到 ELISA 板后，必須對其進(jìn)行孵育，以便有時間進(jìn)行結(jié)合或反應(yīng)。每次孵育的溫度和持續(xù)時間將取決于測定步驟和所執(zhí)行的操作。通常在 37 ° C下孵育 1 小時，例如在上樣后。然而，諸如封閉之類的步驟可以在冰箱中進(jìn)行過夜，并且檢測期間的孵育通常在室溫下進(jìn)行更短的時間。

  

  洗滌

  

  洗板是應(yīng)用測定的每個成分直至檢測之間的重要步驟。清空孔中的溶液后，用緩沖液（通常是磷酸鹽緩沖鹽水-Tween 20 (PBST) ）清洗孔，以去除任何殘留的未結(jié)合抗原、抗體或試劑。這可以使用多通道移液器手動完成或使用自動洗板機完成。清洗不充分可能會導(dǎo)致背景信號較高，而清洗過多可能會導(dǎo)致樣品信號較低。不一致的洗滌可能會導(dǎo)致整個板的不一致，從而導(dǎo)致結(jié)果不可靠。

  

  封閉

  

  用蛋白質(zhì)包被 ELISA 板后，通常需要進(jìn)行封閉，以防止后續(xù)操作步驟中檢測抗體的任何非特異性結(jié)合（圖 2）。將與測定無關(guān)的混合蛋白質(zhì)添加到板中并在板中孵育，占據(jù)任何可用的非特異性結(jié)合位點。常見的蛋白質(zhì)封閉緩沖液選擇包括脫脂奶粉、牛血清白蛋白 (BSA) 和酪蛋白。或者，非離子去污劑，如 Tween 20 或 Triton X-100，可用作封閉劑，但不能提供像蛋白質(zhì)一樣的永久封閉。無效的板封閉會導(dǎo)致背景噪音增加并降低測定的靈敏度和特異性。

封閉過程如何防止非特異性結(jié)合

  

  抗體

  

  實驗抗體是大多數(shù) ELISA 的基石，選擇正確的抗體至關(guān)重要，尤其是在使用多種抗體的情況下。單克隆抗體和多克隆抗體都可以使用，每種抗體都有自己的優(yōu)點和局限性。單克隆抗體具有較高的特異性，但成本較高。另一方面，多克隆抗體可以在多個結(jié)合位點結(jié)合靶標(biāo)，從而放大信號并提高靈敏度。

  

  使用二抗的方法增加了額外的步驟，延長了測定時間，增加了出錯的機會，并且需要更多的優(yōu)化來找到合適的相容抗體對。然而，使用多克隆二抗所帶來的靈敏度增益可能使得這對于開發(fā)有效的測定是有價值的或必要的。

  

  檢測

  

  無論使用哪種 ELISA 類型，都以檢測步驟結(jié)束，最常見的是利用酶介導(dǎo)的可見顏色變化化學(xué)，然后可以使用紫外-可見分光光度法進(jìn)行測量。將酶結(jié)合的抗原或抗體施加到測試孔中，如果其目標(biāo)存在，它將結(jié)合。當(dāng)酶的適當(dāng)?shù)孜锾砑拥桨逯袝r，它會引起顏色變化，顏色變化與孔內(nèi)結(jié)合的靶標(biāo)量成正比。辣根過氧化物酶 (HRP) 是一種常見的綴合物，與底物 3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺 (TMB) 配合使用，它會因 HRP 的反應(yīng)而變成藍(lán)色，然后在添加硫酸溶液時變成黃色，從而停止的反應(yīng)。

  

  然后可以使用酶標(biāo)儀（添加終止液后的 TMB 為 450 nm）（一種紫外-可見分光光度計）確定每個孔的吸光度值，并進(jìn)行校正和計算，例如減去平均空白根據(jù)測定設(shè)計進(jìn)行孔值、技術(shù)重復(fù)的平均或與標(biāo)準(zhǔn)的比率計算。

  

  ELISA試劑盒注意事項及安全說明

  

  一、防范措施

  

  1.本試劑盒僅供研究使用，不可用于診斷或治療程序。

  

  2. 試劑盒不得超過有效期使用。

  

  3. 請勿混合不同批次的試劑。

  

  4. 試劑盒的設(shè)計和測試旨在檢測手冊中所示的特定目標(biāo)和樣品。將此套件用于其他目的應(yīng)由最終用戶仔細(xì)驗證。

  

  二、安全守則

  

  1.本試劑盒提供的終止液是酸性溶液。使用試劑時要小心，避免風(fēng)險。

  

  2. 所有生物材料均應(yīng)按照當(dāng)?shù)胤煞ㄒ?guī)作為潛在危險進(jìn)行處理和丟棄。

  

  3.出于安全考慮，實驗中需要個人防護裝備，如實驗服、手套、手術(shù)口罩和護目鏡。

  

  如何有效利用ELISA試劑盒使用說明書

  

  在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，ELISA試劑盒作為一種常用的實驗工具，其使用說明書的正確利用對于確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性至關(guān)重要。那么，如何有效利用ELISA試劑盒使用說明書呢？

  

  首先，仔細(xì)閱讀并全面理解說明書的內(nèi)容是關(guān)鍵。用戶應(yīng)仔細(xì)研讀說明書，確保對試劑盒的組成、試劑的用途、實驗步驟、反應(yīng)條件以及注意事項等有清晰的認(rèn)識。這有助于用戶更好地掌握實驗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，避免在操作過程中出現(xiàn)錯誤或遺漏。

  

  其次，遵循說明書中的操作步驟和注意事項至關(guān)重要。說明書中的操作步驟是經(jīng)過精心設(shè)計和驗證的，遵循這些步驟可以確保實驗的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。同時，說明書中的注意事項也是實驗成功的關(guān)鍵，用戶應(yīng)嚴(yán)格按照要求進(jìn)行操作，避免出現(xiàn)安全問題或?qū)嶒炇〉那闆r。

  

  此外，當(dāng)遇到實驗問題或異常結(jié)果時，用戶應(yīng)及時查閱說明書中的故障排除部分。說明書中通常會提供一些常見問題的解決方案，用戶可以根據(jù)這些建議進(jìn)行排查和調(diào)整，從而快速解決問題并恢復(fù)實驗的正常進(jìn)行。

  

  最后，用戶還應(yīng)關(guān)注說明書的更新與版本變化。隨著科研技術(shù)的不斷進(jìn)步和試劑盒的不斷優(yōu)化，說明書的內(nèi)容也可能會有所更新。因此，用戶應(yīng)定期查看說明書的最新版本，以便了解最新的實驗方法和操作要求，確保實驗的準(zhǔn)確性和可靠性。

  

  總之，有效利用ELISA試劑盒使用說明書是提升科研效率與準(zhǔn)確性的重要途徑。用戶應(yīng)仔細(xì)閱讀、遵循說明書的要求，并及時查閱更新內(nèi)容，以確保實驗的順利進(jìn)行和結(jié)果的可靠性。

  

  上述是elisa試劑盒說明書介紹，通過上述的介紹，大家對elisa有個簡單認(rèn)識。大家在購買的elisa試劑盒通常會自帶說明書，在實驗前可以仔細(xì)越多說明書，了解實驗的注意事項和試劑存儲方法。