1983年，美國生物化學家卡里·穆利斯(Cary Mullis)提出了核酸體外擴增的想法，并于1985年發明了聚合酶鏈式反應(PCR)過程，從而誕生了PCR技術。1988年，Saiki等人成功地使用從植物中分離出來的耐熱DNA聚合酶自動擴增DNA DNA聚合酶使PCR變得更加方便，這使其成為一種通用的分子生物學技術。

  在傳統PCR技術在分子生物學各個領域廣泛應用時，常常出現樣本量小、樣本珍貴、非特異性擴增等現象。非特異性擴增可能由以下原因引起：常規設備DNA聚合酶的最佳溫度為72℃，此時酶活性最高，酶活性下降。此外，DNA聚合酶在低溫下被激活，導致錯誤的引物序列延伸并形成引物二聚體。熱啟動高保真酶也會出現非特異性擴增，主要是由于PCR條件（Mg2+、退火溫度、循環次數），ETC）。非特異性可能導致：目標擴增子產量低、目標擴增子靈敏度降低、下游應用效率低。

  今天上海通蔚將帶大家科學討論PCR如何放大所需的目標片段，通常方法如下：

  1、直接PCR

  直接PCR是指直接從樣品中擴增靶DNA，無需分離或純化核酸。

  在高溫變性步驟中，細胞或組織等樣品在特殊配制的緩沖液中裂解，然后釋放DNA。直接PCR簡化了工作流程并減少了操作步驟。從而防止純化步驟中DNA丟失。菌落PCR鑒定是現代分子生物學實驗室直接PCR最典型的應用。簡單處理或稀釋后的樣品可直接進行PCR。

  2、梯度PCR

  梯度PCR和降落PCR都優化反應體系的退火溫度，但原理不同。

  梯度PCR用于不清楚退火溫度的情況。為確定最佳退火溫度，多管PCR同時運行PCR儀一臺（需要支持設置梯度退火溫度的PCR儀）。將每個管放置在儀器內的不同列或行中，并單獨運行PCR（例如，對于50-60°C的溫度范圍，將6個管放置在50°C、52°C和54°C）C).C、56°C)、58°C和60°C，分別)。最后確定最佳退火溫度，并在此退火溫度下進行常規PCR擴增。

  3、降落PCR技術

  PCR系統的許多組件如引物、模板、Mg2+、dNTP等都可能導致實驗結果不準確。可能發生。對于復雜的基因組DNA模板，傳統PCR常常伴隨非特異性擴增，無法產生理想的目標產物。為了解決PCR中非特異性擴增的問題，Dong等人。1991年，他發明了降落PCR（TD-PCR）技術。

  降落PCR與梯度PCR相比具有以下優點：首先，選擇合適的梯度PCR退火溫度需要多次反應或多管反應。其次，即使通過多次實驗確定了最佳退火溫度，如果更換其他PCR設備并進行相同的擴增，最佳退火溫度也可能會發生變化。這時，需要重新確定最佳退火溫度。而降落PCR只需一次反應即可獲得良好的擴增效果，并且避免了對每對引物最佳復性溫度的優化和確定。此外，降落PCR顯著緩解了儀器性能對擴增效果的限制。

  原則

  PCR中的退火溫度會影響擴增結果。隨著退火溫度升高，擴增特異性增加，但擴增效率降低。在降落PCR開始時，進行高溫擴增以獲得特異性擴增產物。目的基因豐度增加后，降低擴增溫度可提高擴增效率。將退火溫度降低至發生非特異性擴增的水平可為特異性擴增產物提供幾何優勢。其余反應中的非特異性位點由于豐度較低而無法與特異性位點競爭，獲得單一主要擴增產物。

  退火溫度設定

  通常，降落PCR的退火溫度范圍為高于Tm值5°C至低于Tm值約10°C，最高可達15°C。在每個溫度下循環1至2次，然后在較低的退火溫度下循環10次。

  應用

  Touchdown PCR適用于經常更換引物的實驗。Touchdown PCR可以讓您快速、特異地獲得所需的擴增片段，而無需知道Tm值，也無需費力確定最佳Tm值。現在許多PCR儀器都包含設置降落PCR的程序，該程序廣泛用于研究。

  4、巢式PCR

  巢式PCR是PCR的一種變體。使用兩對PCR引物對（而不是單個引物）來擴增特定片段。第一對PCR引物擴增片段，與傳統PCR類似。第二對引物是嵌套引物（因為它們位于或嵌套在第一個片段內），a>結合在第一個擴增子內并特異性擴增第一個擴增子內的DNA片段。

  優勢

  如果在第一次擴增中產生了錯誤的片段，該區域在第二輪中被第二對引物對擴增的概率非常低。。因此，巢式PCR具有較高的擴增特異性。

  實驗過程

  步驟1：

         第一對引物（以綠色顯示）與DNA目標模板結合。由于特異性不足，它還可能與具有相似結合位點的其他片段結合并擴增靶標。

第二步：使用第二對橙色引物與第一步擴增的目標片段結合，進行第二次擴增。這些引物嵌套在第一個PCR產物中，因此非特異性擴增的PCR產物包含兩個引物對。它不太可能包含結合位點。這可以防止第二組引物擴增非目標片段。這種嵌套式PCR擴增確保了第二次PCR擴增的PCR產物很少或沒有受到來自替代引物目標序列的非特異性擴增PCR產物的污染。

上述是PCR擴增實驗，為大家介紹實現擴增的一些方法，這些方法是我在此領域為大家總結的經驗，希望大家在實驗過程可以根據自身的需求進行選擇。上海通蔚有PCR試劑盒，如果您需要了解更多PCR試劑盒，歡迎咨詢。