細胞為什么傳代？如果繼續在同一容器中培養細胞，培養密度會逐漸增加，導致細胞老化和細胞死亡。為了防止這種情況，將少量細胞移植到另一個容器中的過程稱為“傳代”。

 

  傳代程序根據細胞的性質略有不同，因此請務必檢查哪種方法適合您正在處理的細胞。在本文中，我們將解釋三種模式的傳代程序：貼壁細胞、抗貼壁細胞和浮動細胞。

 

  貼壁細胞的傳代

 

  首先，我們來談談如何傳代貼壁細胞。貼壁細胞在體外生長，直到培養容器的表面被細胞覆蓋或直到培養基耗盡營養。最好在細胞增殖到這種程度之前進行傳代。

 

  為了傳代細胞，首先將它們重組成懸浮液。盡管細胞附著程度因每個細胞系而異，但通常使用胰蛋白酶等蛋白酶將細胞從培養容器中分離出來。然而，這種方法可能并不適合所有細胞系，因為蛋白酶可能會干擾某些細胞系，或者酶可能會消化感興趣的膜標記物或受體蛋白。在這種情況下，另一種方法是用細胞刮刀等物理刮除細胞并將其添加到少量培養基中以產生懸浮液。

 

  貼壁細胞傳代步驟

 

  步驟一：檢查細胞狀態

 

  步驟二：從容器中取出介質

 

  步驟三：用PBS(-)清洗（必要時重復）

 

  步驟四：添加胰蛋白酶/EDTA

 

  步驟五：孵育2-10分鐘

 

  步驟六：檢查細胞狀態

 

  步驟七：添加新鮮培養基并懸浮

 

  步驟八：在裝有溫熱培養基的培養容器中播種

 

  步驟久放入培養箱中

 

  所需設備和試劑如下

 

  1、將培養基加熱至37°C（或細胞隨附的ECACC細胞系數據表上推薦的溫度）

 

  2、70%乙醇

 

  3、PBS(-)（不含Ca 2+/Mg 2+的PBS）

 

  4、0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液

 

  5、胰蛋白酶抑制劑

 

  6、臺盼藍

 

  7、孵化器

 

  8、培養容器和標簽

 

  9、倒置顯微鏡、相差顯微鏡

 

  10、離心機

 

  11、血球計數板（血球計數板）

 

  12、記號筆

 

  13、移液器

 

  14、用于放置小瓶的架子

 

  如何傳代貼壁細胞

 

  下面我們就來看看具體的步驟吧。

 

  步驟一、檢查細胞狀態

 

  使用顯微鏡觀察細胞的狀態（沒有細菌或真菌等污染物）和匯合度（大約匯合度的百分比）。

 

  步驟二、從容器中取出介質

 

  打開抽吸器，用移液器吸取培養容器中的培養基并丟棄。吸取培養基時，稍微傾斜容器，從最深處吸取液體。最好從盡可能靠近培養皿或燒瓶側面的地方吸起。

 

 

  步驟三、用PBS清洗細胞

 

  用培養用大約一半體積的PBS(-)（不含Ca 2+/Mg 2+的PBS）清洗細胞表面。如果細胞牢固附著，請重復幾次。

 

  步驟四、添加胰蛋白酶/EDTA

 

  將1 mL胰蛋白酶/EDTA添加到25 cm的細胞表面進行清洗。緩慢旋轉培養容器，使胰蛋白酶均勻分布在細胞表面，然后丟棄多余的胰蛋白酶。

 

  步驟五、孵化

 

  將培養容器放回培養箱中培養2至10分鐘。

 

  步驟六、檢查細胞狀態

 

  在顯微鏡下觀察細胞并確認細胞開始漂浮。如有必要，用手指輕輕敲擊培養容器的側面以松開任何卡住的細胞。

 

  步驟七、添加新鮮培養基并懸浮

 

  將細胞重懸于含有少量血清的培養基中以滅活胰蛋白酶。但是，請注意，如果您使用無血清培養基，則需要使用胰蛋白酶抑制劑滅活胰蛋白酶。從懸浮液中取出約100-200μL，用臺盼藍等染色，并使用血細胞計數器對細胞進行計數。

 

  步驟八、在裝有溫熱培養基的培養容器中播種

 

  用溫熱的培養基填充新標記的培養容器并轉移所需量的細胞。（請以ECACC細胞系數據表上記載的適量為標準。）

 

  步驟九、放入培養箱中

 

  在數據表中指定的適當條件下孵育細胞。

 

  根據細胞的生長狀況重復上述步驟。

 

  貼壁細胞傳代技巧

 

  執行此操作時需要記住幾點。首先，根據某些細胞系的生長水平，它們可能會輕微粘附在表面并容易脫落。經常檢查培養容器內的條件，注意不要在細胞尚未成熟時使細胞脫落。

 

  在步驟3中，用PBS(-)沖洗細胞表面，去除培養基中含有的血清。此步驟非常重要，因為胰蛋白酶在血清存在下不具有活性。

 

  當對細胞使用胰蛋白酶/EDTA時，請使用分離細胞所需的最短處理時間。長時間接觸可能會損害細胞表面受體。非酶細胞分離劑（例如胰蛋白酶）也可用于分離細胞。建議在必要時使用它，例如當您想在溫和的條件下去角質時。

 

  將新細胞接種到培養容器中時，除非用血清中和胰蛋白酶，否則細胞不會粘附。除了使用血清外，胰蛋白酶抑制劑（例如源自大豆的抑制劑）也可用于中和胰蛋白酶。在這種情況下，首先將等體積的胰蛋白酶抑制劑（濃度1 mg/mL）添加到待中和的懸浮液中。然后，離心混合物，棄去上清液，并重懸于新鮮培養基中。當在無血清培養基中培養時，該過程特別有效。

 

  如果沒有CO 2培養箱，則用含有0.2μm過濾滅菌的5%CO 2空氣進行氣體交換1-2分鐘。

 

  如果收獲的細胞密度不夠，以150 x g離心5分鐘，然后重懸于少量培養基中。

 

  半貼壁細胞的傳代

 

  根據細胞系的類型，所有細胞可能不會粘附在培養容器上，并且可能部分培養為懸浮液。這些細胞必須傳代以維持其細胞狀態。

 

  所需的一般流程、設備和試劑與貼壁細胞相同，但詳細步驟有所不同。

 

  一、檢查細胞狀態

 

  使用顯微鏡觀察細胞的狀態（沒有細菌或真菌等污染物）和匯合度（大約匯合度的百分比）。此時，如果通過敲擊或搖動培養容器的側面將細胞從培養容器中提起，則不再需要胰蛋白酶處理。

 

  二、從容器中取出介質

 

  用移液器去除含有非貼壁細胞的培養基。不要丟棄該介質，而是將其保存在無菌離心管中。

  三、用PBS清洗細胞

 

  對于培養容器表面上剩余的每25 cm2細胞，用1-2 mL PBS(-)清洗細胞表面。將洗滌后的PBS(-)保存在單獨的管中。

 

  四、添加胰蛋白酶/EDTA

 

  用1 mL胰蛋白酶-EDTA清洗25 cm的細胞單層表面。緩慢旋轉培養容器，使胰蛋白酶遍布細胞表面，然后丟棄多余的胰蛋白酶。

 

  五、孵化

 

  將培養容器放回培養箱中培養2至10分鐘。

  六、檢查細胞狀態

 

  在顯微鏡下觀察細胞并確認細胞開始漂浮。如有必要，用手指輕輕敲擊培養容器的側面以松開任何卡住的細胞。

 

  七、添加新鮮培養基并懸浮

 

  將提起的細胞轉移至離心管中，加入保留的培養基，并將整個懸浮液以150×g離心5分鐘。棄去上清液，將細胞沉淀重懸于少量新鮮培養基（10-20 mL）中，并對細胞進行計數。

 

  八、將細胞接種到新容器中

 

  將所需量的細胞放入新的培養容器中，并用新鮮培養基稀釋至所購買細胞數據表上建議的細胞密度。

 

  每2-3天重復一次上述步驟。

 

  基本的預防措施與貼壁細胞的預防措施沒有太大區別。

  大多數細胞被胰蛋白酶分離，但通過添加EDTA可以進一步增強效果。

 

  胰蛋白酶在血清存在下不具有活性。因此，在步驟3中，與貼壁細胞一樣，通過用PBS(-)沖洗細胞表面來除去培養基中含有的血清。反復加熱至37度也可能導致胰蛋白酶活性下降。

 

  此外，當對細胞使用胰蛋白酶-EDTA時，處理時間應保持最短，就像貼壁細胞一樣。對于半貼壁細胞，接觸胰蛋白酶的時間比正常貼壁細胞短得多。

 

  將新細胞接種到培養容器中時，除非用血清中和胰蛋白酶，否則細胞不會粘附。除了使用血清外，胰蛋白酶抑制劑（例如源自大豆的抑制劑）也可用于中和胰蛋白酶。

 

  如果沒有CO 2培養箱，則用含有0.2μm過濾滅菌的5%CO 2空氣進行氣體交換1-2分鐘。

 

  浮游細胞的傳代

 

  大多數浮游細胞是血細胞來源的細胞（淋巴細胞等），并在懸浮液中培養。這些細胞可以作為單個細胞或成簇生長（例如，EBV轉化的B淋巴母細胞）。這種類型可以通過稀釋培養相對容易地傳代。然而，在某些情況下，例如形成團塊的細胞系，必須將細胞離心至單個細胞，然后在計數前重新懸浮。

 

  首先，讓我們檢查一下總體流程。請注意，僅當步驟3適用時才會執行標有星號(*)的步驟。

 

  1、檢查細胞狀態

 

  2、（150×g離心5分鐘）*

 

  3、（在新鮮培養基中添加約10-20%的條件培養基）*

 

  4、采集細胞樣本

 

  5、測量細胞密度，稀釋至適當密度，并懸浮在新培養基中。

 

  6、每2-3天重復一次上述操作

 

  所需設備和試劑如下

 

  1、將培養基加熱至37°C（或細胞隨附的ECACC細胞系數據表上推薦的溫度）

 

  2、70%乙醇

 

  3、臺盼藍

 

  4、孵化器

 

  5、培養容器和標簽

 

  6、倒置顯微鏡、相差顯微鏡

 

  7、離心機

 

  8、血球計數板（血球計數板）

 

  9、記號筆

 

  10、移液器

 

  11、用于放置小瓶的架子

 

  如何傳代浮游細胞

 

  現在，我們就來看看具體的步驟。為了避免對細胞造成壓力，該方案建議通過將細胞添加到新的培養基中并傳代來稀釋細胞。另一種方法是離心，除去上清液，然后將細胞重懸于新鮮培養基中。

 

  一、檢查細胞狀態

 

  在顯微鏡下檢查細胞的狀態。如果細胞呈圓形、明亮且反光，則處于對數生長期。這時我們還要檢查是否有細菌、霉菌等污染物。

 

  二、分散細胞

 

  對于容易粘附在培養容器上的細胞，例如雜交瘤，可通過輕輕敲擊容器將其去除，或使用橡皮警察將其從容器中去除。或者，通過移液分散細胞。這是因為EBV轉化的細胞可能形成單個大團塊，從而難以對中心的細胞進行計數。

 

  如何從過度生長中恢復

 

  如果更換前的培養基顏色呈酸性（含有酚紅的培養基變黃），則細胞可能已經過度生長，恢復可能很困難。在這種情況下，可以通過以下方式進行恢復：以150 x g離心約5分鐘，以比所附數據表中推薦濃度稍高的細胞密度接種到新培養基中，并添加約10至20%的條件培養基。。

 

  1、采集細胞樣本并進行計數

 

  從細胞懸浮液中取出少量（100-200μL），用臺盼藍染色，并對細胞進行計數。計算每毫升的細胞數，將所需量放入新的培養容器中，并用新培養基稀釋至細胞隨附的數據表上推薦的細胞濃度。

 

  每2-3天重復一次上述步驟。

 

  如果培養的細胞系是雜交瘤或產生重組蛋白或生長因子的細胞，則傳代后的舊培養基也應保留以供以后分析。

 

  步驟3中使用的條件培養基也稱為條件培養基。指細胞培養一定時間（數小時至數天）后收集的培養上清液。含有細胞生長因子、細胞粘附因子、細胞毒性中和因子等，可能有助于細胞增殖和功能表達。

 

  上面，我們已經解釋了細胞傳代的步驟。除了細胞類型之外，不同的細胞系可能需要不同的程序和條件。實際使用細胞進行實驗時，請務必仔細閱讀細胞附帶的數據表，并在處理細胞時參考文獻。