核酸擴增和檢測技術是當今生物研究中最有價值的工具之一。生命科學各個領域（基礎研究、生物技術、醫學、法醫學、診斷學等）的科學家在廣泛的應用中利用這些方法。對于某些應用，定性核酸檢測就足夠了。然而，其他應用則需要定量分析。實時熒光定量PCR可用于定性和定量分析；為您的應用選擇最佳方法需要對該技術有廣泛的了解。上海通蔚蔚您介紹實時 PCR、反轉錄定量 PCR 技術以及 Bio-Rad 為這些技術提供的儀器選擇。它還提供了 RNA 分離步驟的提示，例如樣品收集、RNA 提取以及分析 RNA 的質量和數量。

  頁面內容

  什么是實時 PCR？

  實時 PCR/qPCR 檢測的應用

  實時熒光定量 PCR 是如何工作的？

  RNA分離

  逆轉錄定量 PCR (RT-qPCR)

  qPCR/實時 PCR 儀器

  什么是實時 PCR？

  在傳統 PCR 中，擴增的 DNA 產物或擴增子在終點分析中進行檢測。在實時 PCR 中，隨著反應的進行，實時測量擴增產物的積累，并在每個循環后進行產物定量。

  下面的 qPCR 工作流程描述了實時 PCR 的步驟。首先，使用 PCR 試劑和獨特或定制引物設置擴增反應。然后在實時 PCR 儀器中運行反應，并通過專有儀器軟件分析收集的數據。

  PCR 產物的實時檢測是通過在每個反應孔中包含熒光報告分子來實現的，隨著產物 DNA 量的增加，熒光報告分子會產生增強的熒光。用于此目的的熒光化學包括DNA結合染料和熒光標記的序列特異性引物或探針。配備熒光檢測模塊的專用熱循環儀用于在擴增發生時監測熒光信號。測得的熒光與擴增子總量成正比；熒光隨時間的變化用于計算每個循環中產生的擴增子的量。

  與 PCR 相比，實時 PCR 的主要優點是，實時 PCR 允許您在寬動態范圍內準確且高靈敏度地確定模板 DNA（擴增目標序列）的初始拷貝數。實時 PCR 結果可以是定性的（序列是否存在）或定量的（拷貝數）。因此，定量實時 PCR 也稱為 qPCR 分析。相比之下，PCR 至多是半定量的。此外，無需凝膠電泳即可評估實時 qPCR 數據，從而減少實驗時間并提高通量。最后，由于在統一的閉管 qPCR 系統中運行實時 qPCR 反應并評估數據，因此減少了污染的機會，并且在 qPCR 分析中消除了擴增后操作的需要。

  實時 PCR/qPCR 檢測的應用

  實時 PCR/qPCR 檢測已成為快速、靈敏地測定和定量各種生物樣品中核酸的首選工具，具有多種應用，例如基因表達分析、食品中轉基因生物的檢測和癌癥表型分析。

  在研究實驗室中，qPCR 檢測廣泛用于定量測量轉化細胞系中的基因拷貝數（基因劑量）或突變基因的存在。與逆轉錄 PCR (RT-PCR) 相結合，qPCR 檢測可通過測量細胞中的變化來精確定量基因表達的變化，例如，響應不同環境條件或藥物治療的表達增加或減少。 mRNA 水平。

  實時熒光定量 PCR 是如何工作的？

  為了了解實時 PCR 的工作原理，我們使用典型的擴增圖來說明 qPCR 分析（圖 1）。在此圖中，x 軸顯示 PCR 循環數，y 軸顯示擴增反應的熒光（與管中擴增產物的量成正比）。

  擴增圖顯示兩個階段，指數階段，隨后是非指數平臺階段。在指數生長期，PCR 產物的量在每個循環中大約翻倍。然而，隨著反應的進行，反應組分被消耗，并且最終一種或多種組分變得有限。此時，反應減慢并進入平臺期（圖 1 中的循環 28-40）。

  最初，熒光保持在背景水平，并且即使產物呈指數累積，也無法檢測到熒光的增加（循環 1-18，圖 1）。最終，積累足夠的擴增產物以產生可檢測的熒光信號。發生這種情況的循環數稱為定量循環或 C q。由于 C q值是在試劑不受限制的指數期測量的，因此實時 qPCR 可用于基于描述反應進程的已知指數函數可靠且準確地計算反應中存在的模板的初始量。

  反應的C q主要由擴增反應開始時存在的模板量決定。如果反應開始時存在大量模板，則需要相對較少的擴增循環來積累足夠的產物以產生高于背景的熒光信號。因此，反應的 C q較低或較早。相反，如果反應開始時存在少量模板，則需要更多的擴增循環才能使熒光信號升至背景之上。因此，反應將具有高或晚的 C q。這種關系構成了實時 PCR 定量方面的基礎。

  RNA分離

  樣品采集

  對于RNA 分離 和基因表達定量，樣品材料應盡可能均勻。如果您的組織樣本由許多不同的細胞類型組成，那么精確定位靶基因的表達模式可能會很困難。如果您有異質樣品，請使用可用于分離和分離特定細胞類型的多種方法之一，例如組織解剖、針活檢和激光捕獲顯微切割。然后可以使用收集的細胞來獲取 RNA 樣本。

  RNA 提取

  總 RNA 或 Poly(A+) RNA 可用于大多數實時 RT-qPCR 應用。使用 RNA 時的一項關鍵考慮因素是消除解決方案、耗材和實驗室器具中的 RNase。您可以購買即用型無 RNase 溶液，也可以用焦碳酸二乙酯 (DEPC) 處理您的溶液，然后進行高壓滅菌。實驗室器具上的 RNase 也可以通過 DEPC 處理或在 250°C 下烘烤 3 小時來滅活。

  制備的 RNA 樣品可能需要 DNase 處理，以防止任何污染基因組 DNA 的潛在擴增，這可能導致高估 mRNA 的拷貝數。然而，當起始材料有限時，DNA酶處理可能是不可取的，因為額外的操作可能會導致RNA損失。通過設計轉錄特異性引物，例如跨剪接點或跨剪接點擴增的引物，可以防止潛在污染的基因組DNA的擴增。

  分析核酸數量和質量

  準確的核酸定量對于基因表達分析至關重要，特別是當使用總 RNA 量來標準化靶基因表達時。RNA濃度和純度通常通過測量 260 nm 和 280 nm 處的 UV 吸光度比率來確定。

  逆轉錄定量 PCR (RT-qPCR)

  有兩種方法可用于通過 RT-qPCR 定量基因表達：兩步 RT-qPCR 和一步 RT-qPCR。在這兩種情況下，RNA 都會逆轉錄為 cDNA，然后將 cDNA 用作 qPCR 擴增的模板。一步和兩步是指RT和實時PCR擴增是在同一管還是分開的管中進行。在兩步法中，RNA 首先在使用逆轉錄酶的反應中轉錄成 cDNA。然后將所得 cDNA 的等分試樣用作多個 qPCR 反應的模板。在一步法中，RT 和 qPCR 在同一管中進行。

  qPCR/實時 PCR 儀器

  實時 PCR 檢測系統由配備光學檢測模塊的熱循環儀組成，用于測量每個擴增循環期間熒光團與目標序列結合時產生的熒光信號。Bio-Rad 實時 PCR 檢測系統 配備帶有可互換模塊的熱循環儀，用于熒光團的單重和多重檢測以及固定的實時 PCR 單元。所有 qPCR 系統均具有熱梯度功能。