酶聯免疫吸附實驗（ELISA）是目前免疫實驗較為靈敏、可重復的技術之一。它快速、簡單易于自動化。與其它實驗一樣，ELISA實驗可重復性和可靠性取決于適當的技術和細節的關注。

  ELISA常見的技術類型

  ELISA常見的技術類型分為直接ELISA、間接ELISA和夾心ELISA。

•   直接ELISA，其中抗原固定在ELISA板上，并且一抗帶有標記（圖1A）

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•   間接ELISA，其中抗原固定在ELISA板上，二抗帶有標記（圖1B）
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•   夾心ELISA，其中兩種一抗（用于捕獲和檢測）嵌入抗原，形成“夾心”，然后復合物被二抗識別（圖1C）。
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  ELISA試劑盒中匹配的抗體對

  配對抗體是指已知可識別同一蛋白質抗原上的不同表位的抗體組，因此它們可以一起用于在夾心ELISA中捕獲和檢測單一抗原。ELISA檢測中使用的抗體可以是單克隆抗體、多克隆抗體或兩者的組合。

  單克隆抗體可用于所有類型的ELISA中所有含抗體的步驟。它們通常以匹配對的形式成套用于夾心ELISA，但可以與多克隆抗體一起用于捕獲或檢測，以增強信號或提供更大的機會從復雜溶液中捕獲抗原。

  由于多克隆抗體溶液中存在的抗體異質性以及表位的廣泛代表性，多克隆抗體可以成為檢測抗原的有力工具，通常比單克隆抗體產生更高的信號水平。然而，多克隆抗體更有可能與密切相關的蛋白質共享一個或多個表位，從而產生更高的非特異性信號。減少此問題的一種方法是使用親和力純化或交叉吸收的多克隆抗體。為了提高檢測靈敏度，ELISA的檢測方法可以從直接檢測轉換為使用多克隆抗體的間接檢測。相關閱讀：《單克隆 vs 多克隆抗體：科研實驗中的抉擇》

  ELISA樣本

  ELISA可以檢測多種樣本，檢測條件的選擇取決于樣本的復雜性和預期存在的抗原量。

  重要的是，要結合已知標準對所有樣本進行兩次或三次測試，以確保結果和定量的準確性。最好對樣本進行多次稀釋測試，以確保最終結果在標準曲線的線性部分內。高濃度樣本可能會低估濃度，而高度稀釋的樣本可能會高估濃度。

  ELISA封閉和清洗步驟

  封閉通常是必要的，以防止檢測抗體與多孔板表面本身的非特異性結合。當板完全封閉時，檢測靈敏度將增強，因為非特異性信號將減少。

  徹底清洗程序對于獲得可靠的ELISA結果至關重要。重要的是，通過輕輕將吸液頭放入底部，將所有孔中的液體完全吸出。避免刮傷孔內。清洗完成后，建議將板倒置并用吸水紙擦干。

  如何優化您的ELISA實驗

  ELISA實驗準確性有助于實驗結果的可靠性，下面結合日常ELISA實驗操作來優化幾點建議：

  1）捕獲抗體濃度

  在包被緩沖液中制備不同濃度的捕獲抗體。

  2）阻斷緩沖液

  準備不同的封閉液。如果封閉液不是預先配制的（即它是單一蛋白質，例如BSA），請嘗試不同濃度的蛋白質。

  3）標準稀釋劑

  嘗試使標準稀釋劑與樣品基質盡可能接近匹配。

  如果基質本身無法精確復制，則測試不同的標準稀釋液，并檢查樣品的標準曲線和稀釋線性。可能需要選擇不同的稀釋劑。

  如果樣品的線性較差，則樣品基質和標準稀釋劑之間可能存在不平衡。在這種情況下，應進行加標回收或稀釋線性實驗。

  4)樣品濃縮

  制備不同濃度的樣品，注意底物的檢測限。為了確認生物樣品基質不會掩蓋或增強信號，應進行加標回收和稀釋線性實驗。

  5）檢測抗體濃度

  制備不同濃度的檢測抗體。

  6）酶結合物濃度

  根據ELISA試劑盒中針對底物描述的范圍，制備不同濃度的酶結合物。

  7）信號檢測

  根據樣品中的抗原量以及用平板讀取器檢測的能力來選擇底物。

  如果可以清楚地檢測到抗原則表明底物是合適的。

  如果抗原低于檢測閾值，則選擇更敏感的底物。

  常見的ELISA問題

  下面上海通蔚為大家匯總了常見ELISA問題，了解這些問題有助于后期在實驗中減少出錯的概率。

  1)ELISA檢測信號弱或無信號

  建議在開始檢測前將所有試劑放置于室溫下15-20分鐘。

  組件儲存不正確。仔細檢查試劑盒標簽上的儲存條件。大多數試劑盒需要儲存在2–8oC的環境中。

  試劑添加/制備不正確。檢查方案，確保試劑以正確的順序添加，并準備正確的稀釋度。

  熒光試劑過度曝光。強光會分解熒光團，導致光漂白。保護熒光團免受光照對于在檢測結束時有效產生信號至關重要。

  組分需要進一步優化。檢測的某一組分可能處于限制濃度，導致整體信號較低。

  試劑降解。其中一種試劑可能已降解或被污染，這種情況下應予以更換。

  抗體配對效率低或對靶標缺乏足夠的親和力。所用的抗體可能無法有效地與抗原結合，或可能無法相互結合發揮作用。在這種情況下，必須測試替代抗體。

  檢測系統需要進一步優化。檢測系統（底物）可能不夠靈敏，無法發出信號，或者標準曲線可能不適合該樣品。可能需要濃縮樣品或切換到更靈敏的底物。

  2）背景高

  清洗或封閉不充分。高背景信號通常是由于清洗或封閉不充分、樣品成分或抗體與封閉緩沖液發生交叉反應，或者使用了過多的酶結合物造成的。

  平衡產生特定信號的酶量與產生背景信號的酶量非常重要。控制這一點的最有效方法是優化酶結合物、抗體和封閉液。

  3）標準曲線線性差

  如果標準曲線的線性較差，則樣品必須在嚴格的濃度范圍內才被視為準確的。

  如果曲線具有良好的線性，但重復之間的變化較差（即標準誤差），則可能存在技術問題，例如樣品或個人用戶之間的移液不一致。

  為了緩解此問題，應至少對所有樣品和標準進行兩次或三次測量。

  4)ELISA信號過高

  清洗不充分。為了避免此問題，請使用適當的清洗程序，例如，在每個清洗步驟結束時，將板倒置在吸水紙上并使其完全排干，必要時用力拍打以去除任何殘留液體。

  孵育時間過長。孵育時間過長也是ELISA信號過高的原因之一；務必遵循建議的孵育時間。

  污染。使用板密封劑可避免此問題，每次打開板時都使用新的密封劑。這將防止孔相互污染。