細(xì)胞培養(yǎng)中最重要的是防止細(xì)胞被細(xì)胞以外的微生物污染，如細(xì)菌、真菌、支原體等。實(shí)驗(yàn)室的空氣中、實(shí)驗(yàn)臺(tái)上、實(shí)驗(yàn)人員的手和手指上、口腔中都存在著多種微生物。這些微生物的繁殖速度比細(xì)胞快，可以通過(guò)從培養(yǎng)基中竊取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或釋放有毒物質(zhì)來(lái)殺死目標(biāo)細(xì)胞。無(wú)菌操作是指為防止這些污染物并僅培養(yǎng)所需的生物材料（細(xì)胞等）而進(jìn)行的操作。本文上海通蔚將為您概述了無(wú)菌技術(shù)和注意事項(xiàng)！

  培養(yǎng)材料和培養(yǎng)設(shè)備的準(zhǔn)備

  首先，我們準(zhǔn)備材料和設(shè)備，以避免將污染源引入進(jìn)行無(wú)菌操作的環(huán)境中。

  所有用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基、試劑、設(shè)備和容器均應(yīng)滅菌。滅菌方法包括使用電烘箱的干熱滅菌、使用高壓蒸汽的高壓滅菌(高壓蒸汽滅菌)以及使用膜過(guò)濾器的過(guò)濾滅菌。

  玻璃移液器（測(cè)量移液器、駒込移液器、巴斯德移液器）裝在移液器罐中并通過(guò)干熱滅菌。此時(shí)，在移液器上放置棉塞可以降低微生物污染率。對(duì)于棉塞，請(qǐng)使用防水的蒲團(tuán)棉代替脫脂棉。微量移液器吸頭裝在特殊的盒子中，用鋁箔包裹，并在高壓滅菌器中滅菌。由于高壓滅菌后芯片上可能會(huì)附著水滴，因此使用前請(qǐng)徹底干燥。

  培養(yǎng)基和試劑滅菌后，進(jìn)行無(wú)菌檢查，確保其完全滅菌。對(duì)于培養(yǎng)基，加入少量培養(yǎng)基和血清；對(duì)于試劑，將少量培養(yǎng)基、試劑和血清放入透明管或35 mm培養(yǎng)皿中，并在37°C培養(yǎng)箱中放置約3天。如果存在污染，培養(yǎng)基會(huì)變得混濁，因此應(yīng)將其丟棄并準(zhǔn)備新的。

  如果無(wú)法使用上述滅菌方法，可用70%乙醇溶液消毒。將儀器和試劑帶入超凈工作臺(tái)或安全柜時(shí)，應(yīng)先用浸有70%乙醇或奧斯本的紗布擦拭外部后再放入。使用乙醇后，立即使用燃?xì)馊紵鲿r(shí)請(qǐng)小心，因?yàn)樗赡軙?huì)著火。

  實(shí)驗(yàn)者準(zhǔn)備

  實(shí)驗(yàn)者本身可能會(huì)引入微生物，因此在進(jìn)行任何操作之前一定要穿著合適。指甲應(yīng)剪短，長(zhǎng)發(fā)應(yīng)扎起來(lái)或塞進(jìn)帽子里。用肥皂徹底清洗雙手和肘部，并用70%乙醇。戴一次性乳膠手套也是一個(gè)好主意，因?yàn)槿绻讣谆蚴种赣邪櫦y而無(wú)法充分消毒，或者手或手指有割傷，微生物可能會(huì)殘留。手套還可以有效降低將病原體從標(biāo)本傳播給實(shí)驗(yàn)人員的風(fēng)險(xiǎn)。

  潔凈工作臺(tái)和安全柜

  無(wú)菌操作在潔凈工作臺(tái)或安全柜（II級(jí)或III級(jí)）等無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行。兩種類型都將空氣通過(guò)稱為HEPA過(guò)濾器的高性能過(guò)濾器輸送到設(shè)備中，從而可以在保持設(shè)備內(nèi)部無(wú)菌的同時(shí)完成工作，但由于它們的機(jī)制和功能不同，因此根據(jù)目的和材料使用它們用過(guò)的。

  潔凈工作臺(tái)在室內(nèi)產(chǎn)生正壓，并保護(hù)樣品免受設(shè)備外部的微生物污染。供氣上有過(guò)濾器，但排氣上沒有過(guò)濾器，因此內(nèi)部樣品可能會(huì)泄漏，使其不適合處理轉(zhuǎn)基因生物和病原體。潔凈工作臺(tái)足以進(jìn)行一般無(wú)菌操作。

  安全柜（II級(jí)或III級(jí)）在供氣和排氣上均配有負(fù)壓和HEPA過(guò)濾器。因此，它不僅可以保持冰箱內(nèi)部無(wú)菌，還可以防止設(shè)備內(nèi)部的微生物泄漏到空氣中，還可以用來(lái)處理重組生物和病原體。

  無(wú)菌操作流程

  使用潔凈工作臺(tái)或安全柜時(shí)，使用前0.5～1小時(shí)打開殺菌燈，使用前關(guān)閉。殺菌燈發(fā)出的紫外線具有很強(qiáng)的殺菌作用，但對(duì)人體和細(xì)胞也有危害，所以工作前一定要關(guān)燈，避免直視殺菌燈。稍微打開門，運(yùn)轉(zhuǎn)風(fēng)扇5至10分鐘，用70%乙醇或奧斯本等消毒劑擦拭工作臺(tái)內(nèi)部，然后開始無(wú)菌操作。操作時(shí)，門打開高度不超過(guò)25厘米。

  如果您攜帶介質(zhì)、試劑或設(shè)備，請(qǐng)先用消毒劑擦拭表面，然后再將其放在工作臺(tái)上。打開培養(yǎng)基瓶或移液罐的蓋子時(shí)，首先用火焰對(duì)蓋子周圍區(qū)域進(jìn)行消毒，因?yàn)槲⑸锟赡軓钠炕蚬薜拈_口處進(jìn)入。

  為防止進(jìn)入工作臺(tái)的微生物和灰塵落入并污染試劑和培養(yǎng)基，請(qǐng)打開煤氣燈或酒精燈以產(chǎn)生向上的氣流。同樣重要的是不要讓試劑瓶、培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿打開，并避免將手或儀器放在打開的蓋子上。

  滅菌后，用消毒液將用過(guò)的試劑、儀器擦拭干凈，然后帶出室外，用消毒液擦拭室內(nèi)。關(guān)上門，關(guān)掉風(fēng)扇，打開殺菌燈。殺菌燈發(fā)出的紫外線會(huì)降解塑料，因此最好在大約一個(gè)小時(shí)后將其關(guān)閉，而不是繼續(xù)打開。

  污染防治措施

  污染大致可分為三種類型：細(xì)菌和真菌污染、支原體和病毒污染以及與其他細(xì)胞的交叉污染。

  細(xì)菌和真菌引起的污染可以通過(guò)肉眼或顯微鏡檢查來(lái)確定，因?yàn)榕囵B(yǎng)基會(huì)因pH值的變化而變得渾濁或變色。然而，支原體和病毒引起的污染和交叉污染很難通過(guò)肉眼或顯微鏡檢查來(lái)區(qū)分，因此很難注意到污染，因此定期進(jìn)行污染檢測(cè)是個(gè)好主意。

  另外，為防止樣本之間的交叉污染（與其他細(xì)胞的污染）和感染，避免同時(shí)將兩種或兩種以上的細(xì)胞帶入實(shí)驗(yàn)臺(tái)，并為每種細(xì)胞準(zhǔn)備一套培養(yǎng)基和試劑。我們開始做吧。

  如果發(fā)現(xiàn)污染，我們將及時(shí)處理，防止感染傳播給他人。

  以上，我們已經(jīng)說(shuō)明了無(wú)菌技術(shù)的概要和注意事項(xiàng)。通過(guò)確保滅菌和無(wú)菌技術(shù)可以在一定程度上防止污染。請(qǐng)務(wù)必理解每一步的含義并仔細(xì)執(zhí)行操作。