酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）是一種用于檢測和定量分析抗原和抗體的實驗室技術(shù)。ELISA與其它免疫檢測技術(shù)相比，操作還是較為簡單。雖說操作簡單，但是實驗中經(jīng)常會遇到一些問題，今天通蔚為大家整理這些常見的問題。

  1.標準曲線不佳

  2.無信號

  3.變異系數(shù)高

  4.背景高

  做ELISA實驗需要注意哪些問題？

  標準曲線不佳

  在ELISA實驗中，標準曲線至關(guān)重要，通過標準曲線可以確定樣品中目標分子濃度。在每次進行ELISA實驗時候，可以使用和準備質(zhì)量控制（QC）樣品。在較為理想的情況下，QC樣品涵蓋了低、中、高濃度，覆蓋標準曲線的整個范。可以將它們分別放在ELISA板左側(cè)和右側(cè)（第1列和第12列）。這些QC樣品的濃度應(yīng)與標準曲線上的濃度不同，模擬已知濃度的實際樣品以進行準確性驗證。

  在理想的情況下，將QC樣品基質(zhì)與您的真實樣品（例如血清或血漿）相匹配。建議提前準備一批QC樣品并將其儲存在-80°C下，就像您的常規(guī)樣品一樣。這樣，您就可以監(jiān)控一段時間內(nèi)或不同生產(chǎn)批次的檢測性能，前提是您的分析物在您的存儲條件下保持穩(wěn)定。 在QC樣品用完之前準備好新的批次，并同時運行新舊兩批QC樣品進行比對，這對于確保實驗結(jié)果的一致性和可靠性至關(guān)重要！

  標準曲線常見問題

  標準曲線的常見問題可能包括不同濃度下的光密度(OD)值不一致，導(dǎo)致曲線擬合度較差且R2值較低（理想情況下，R 2應(yīng)>0.99）。常見問題如下：

  問題1標準溶液不正確

  使用錯誤濃度的標準起始溶液可能會導(dǎo)致標準稀釋不足或過度稀釋，從而導(dǎo)致OD偏差并使標準曲線超出范圍。

  解決辦法：仔細檢查標準儲備液濃度、稀釋計算和稀釋度。如果您要從凍干小瓶中重構(gòu)標準品，請確保遵循廠家的說明。建議渦旋小瓶以確保完全重構(gòu)。

  問題2降解標準

  過有效期或儲存不當?shù)臉藴势房赡芤呀?jīng)降解，導(dǎo)致OD值低于未降解的標準。

  解決辦法：驗證標準品是否正確重構(gòu)或適當存儲

  問題3曲線不符合比例

  即使你認為曲線沒問題，也可能觀察到比平時更高或更低的OD值。這可能是由于檢測試劑批次不同等因素導(dǎo)致吸光度變化。

  解決辦法：首次使用ELISA試劑盒時，請確保使用推薦的曲線擬合模型，通常是4或5參數(shù)邏輯曲線擬合模型(4-PL或5-PL)。如有必要，請嘗試其他曲線擬合模型，如對數(shù)-對數(shù)。一致性是關(guān)鍵，因此更改曲線擬合模型可能會導(dǎo)致您的結(jié)果在檢測之間無法比較，尤其是在需要絕對值的情況下。

  問題4移液誤差

  向板中添加樣品時可能會發(fā)生移液誤差，例如樣品量不正確或變異系數(shù)(CV)過高。

  解決辦法：為了最大限度地減少移液錯誤，請確保移液器吸頭牢固連接，在試劑和樣品之間更換吸頭，消除孔或移液器吸頭中的氣泡，將試劑/樣品分配到孔的側(cè)面，并通過連續(xù)的抽吸/分配循環(huán)沖洗吸頭。

  注意事項：可以先暫時保留您實驗試管，一直到分析結(jié)果完成。保留用于制備標準品、QC樣品和樣品的試管，可以讓您在稍后發(fā)現(xiàn)錯誤時仔細檢查稀釋錯誤或試管混淆。

  無信號

  由于ELISA中的每個步驟都至關(guān)重要，信號缺失的潛在原因有很多，因此故障排除是一個綜合過程。常見問題如下：

  問題1無樣品信號，但標準品或QC樣品良好

  如果您的標準/校準曲線和/或QC樣品顯示信號，但您的樣品沒有（如預(yù)期），則您的樣品可能有問題。可能出現(xiàn)以下幾種問題：

  1.使用新的樣本基質(zhì)：ELISA實驗的成功與否很大程度上取決于樣本基質(zhì)和所選用的ELISA試劑盒的兼容性。不同的樣本類型（例如血清、血漿、尿液、組織勻漿、細胞培養(yǎng)上清等）具有不同的成分和特性，這些差異可能會影響ELISA實驗的結(jié)果。

  2.稀釋度過高：樣品過度稀釋超過ELISA的靈敏度可能會導(dǎo)致信號丟失。

  3.降解樣本

  完全無信號

  有多種原因可能導(dǎo)致零信號產(chǎn)生：

  1.孵育時間/溫度：驗證孵育時間和溫度是否符合廠家要求，以避免影響檢測動力學。

  2.捕獲/檢測抗體不足/不正確：仔細檢查抗體稀釋度，特別是內(nèi)部制備的試劑，并確保正確訂購廠家提供的即用型試劑。

  3.添加的捕獲/檢測試劑不足：確保向板中添加了正確量的試劑。

  4.讀取器波長：確認您的平板讀取器上的波長設(shè)置正確，特別是在使用需要視覺停止的底物時。

  5.底物溶液：使用正確的底物并檢查儲備溶液的有效期。

  6.洗板：避免過度劇烈或長時間洗板，因為這可能會洗掉分析物或試劑。

  7.干燥孔：防止孔變干，以避免出現(xiàn)不可預(yù)測的ELISA問題。

  高CV

  高CV可能表現(xiàn)為重復(fù)孔之間的光密度讀數(shù)存在顯著差異，并且可能對板的某些部分產(chǎn)生不同的影響。解決問題取決于確定高CV的具體位置，因為它會影響曲線擬合和結(jié)果可靠性。

  以下是ELISA中CV值高的一些常見原因：

  1.移液誤差：雖然通常歸因于移液誤差，但高CV也可能由樣品制備、試劑處理和清洗步驟中的錯誤造成。確保稀釋樣品混合正確，以避免重復(fù)樣品之間存在差異。

  2.樣品準備：將稀釋樣品加入板中之前，大力混合或用移液器吸出稀釋樣品，以避免分析物分布不一致。

  3.試劑準備：試劑（如捕獲抗體或檢測抗體）混合不當可能會導(dǎo)致不同孔中的試劑水平不同，從而增加CV。

  4.洗板：確保徹底、一致地洗板，以防止板上殘留基質(zhì)成分，導(dǎo)致背景信號增加。

  5.孔內(nèi)氣泡：移液時盡量減少氣泡，因為氣泡會干擾分析物或試劑。讀取板前應(yīng)消除所有可見氣泡。

  6.邊緣效應(yīng)：注意邊緣效應(yīng)，這可能是由于板上的溫度差異造成的。控制溫度并確保適當?shù)脑噭┗旌峡梢跃徑獯藛栴}。

  高背景

  ELISA中的高背景表現(xiàn)為整個板的顏色顯色或光密度讀數(shù)過高。高背景會增加信噪比，降低檢測靈敏度并可能導(dǎo)致結(jié)果不可用。高背景通常有兩個主要原因：板清洗和板阻塞。

  如果您在一段時間內(nèi)做大量相同的ELISA，請將空白（陰性對照）、標準和任何QC樣品孔的光密度制成表格。這可以讓您了解檢測或試劑是否隨時間而變化，從而導(dǎo)致檢測動力學逐漸發(fā)生變化。

  1.基于抗體問題

  包被/檢測抗體濃度：在ELISA實驗中，包被抗體（也稱為捕獲抗體）的濃度非常關(guān)鍵，需要仔細選擇和優(yōu)化，特別是當你不是使用現(xiàn)成的試劑盒，而是從頭開始開發(fā)ELISA方法時。

  非特異性結(jié)合：檢查抗體的配方，確保所用的稀釋劑合適，因為不兼容的稀釋劑會導(dǎo)致非特異性結(jié)合。充分的板封閉對于減少非特異性結(jié)合至關(guān)重要。

  交叉反應(yīng)性：當轉(zhuǎn)換新批次、新供應(yīng)商或新類型的抗體時，請使用陰性對照檢查是否與樣品類型中的其他分析物發(fā)生交叉反應(yīng)。

  2.試劑（緩沖液或底物）問題

  污染：由于之前的背景較高而重復(fù)檢測時，請始終使用新鮮試劑。受污染的緩沖液可能導(dǎo)致背景較高。

  3.板材阻擋：

  封閉緩沖液在檢測中至關(guān)重要，因為它可以防止非特異性結(jié)合。為了降低高背景，可以考慮增加封閉溶液的濃度或添加少量非離子洗滌劑，例如Tween-20。延長封閉步驟的孵育時間和使用平板振蕩器也有幫助。

  4.洗板：

  洗板不充分會導(dǎo)致基質(zhì)成分殘留在板上，從而導(dǎo)致背景信號增加。清洗步驟或在清洗步驟之間短暫孵育可有效降低背景。確保自動洗板機正常運行，并且在更換清洗緩沖液之間管路清潔且沖洗干凈。

  5.基底問題：

  如果反應(yīng)未在規(guī)定時間內(nèi)停止，某些底物（如TMB）可能會沉淀。請遵循制廠家的建議，并在添加終止液后立即讀取板。確保檢測板底部清潔，以防止干擾板讀取器。