ELISA是酶聯免疫吸附分析的縮寫。在這種實驗方法中，使用免疫吸附劑（與固體表面結合的抗原或抗體）和酶聯免疫反應物。例如，ELISA用于利用未標記的未知物和標記的反應物之間的競爭性結合來檢測未知濃度。ELISA不但成為了一種非常簡便的研究工具，而且迅速地應用于各種生物活性物質及標志物的臨床檢測，并在臨床應用中逐步取代了放免技術。下面上海通蔚為大家全面了解ELISA實驗原理、步驟和注意事項.

  ELISA試劑盒原理

  ELISA（酶聯免疫吸附測定） 是一種將抗原、抗體的免疫反應和酶的高效催化反應有機結合而發展起來的一種綜合性技術。其基本原理是利用抗原抗體反應的特異性，將待測物質與酶標記的抗體或抗原結合，通過酶催化底物顯色反應，根據顏色深淺進行定性或定量分析。根據抗原抗體反應的結合方式，有直接法、間接法、夾心法、競爭法等。下面詳細介紹：

  直接ELISA

  在直接ELISA中，待測抗原被吸附到反應板的孔中，并進行洗滌去除未結合的抗原。隨后，添加酶標記的抗體，該抗體能夠特異性識別抗原。抗體與抗原結合后，加入底物溶液，酶催化底物發生顏色變化，顏色變化的程度與樣本中抗原的含量成正比。


  優缺點分析:

  1.優點:

• 操作簡單快速：直接ELISA僅使用一種抗體，步驟較少，減少了誤差的可能性，提高了實驗效率。

• 避免交叉反應：直接ELISA不使用第二抗體，因此可以避免第二抗體與其他抗體的交叉反應，提高檢測的特異性。

  2.缺點:

• 抗體標記難度：為每種抗原準備相應的標記抗體，需要額外的時間和成本。

• 靈敏度較低：由于標記抗體的密度較低，直接ELISA的靈敏度可能低于間接ELISA。

  在直接ELISA法中，為了提高直接ELISA法的靈敏度，可以嘗試以下幾種方法：

  1.使用高親和力的標記抗體：

  選擇與抗原結合能力更強的標記抗體，可以提高抗原的識別效率，從而提高靈敏度。

  可以使用單克隆抗體，因為單克隆抗體具有更高的特異性和親和力。

  2.優化標記方法：

  可以嘗試不同的標記方法，例如使用更有效的酶或熒光標記物，以提高標記效率和靈敏度。

  可以嘗試對抗體進行優化，例如改變抗體的結構或進行修飾，以提高其標記效率。

  3.提高抗原的包被密度：

  在進行ELISA實驗時，可以通過增加抗原的包被濃度或延長包被時間，提高抗原在反應板上的吸附密度，從而提高檢測靈敏度。

  4.使用信號放大技術：

  可以使用一些信號放大技術，例如生物素-鏈霉親和素系統，來放大信號，提高檢測靈敏度。

  5.使用更靈敏的檢測方法：

  可以使用更靈敏的檢測方法，例如化學發光檢測法，來提高檢測的靈敏度。

  6.優化實驗條件：

  優化實驗條件，例如調整孵育時間、洗滌步驟、底物濃度等，可以提高實驗的效率和靈敏度。

  7.使用更敏感的試劑盒：

  選擇專門為提高靈敏度設計的直接ELISA試劑盒，例如使用高靈敏度的酶標記抗體或高靈敏度的底物。

  間接ELISA

  間接ELISA使用兩種抗體：第一抗體（一抗）特異性識別待測抗原，第二抗體（二抗）特異性識別一抗。首先，待測抗原被吸附到反應板的孔中，并進行洗滌去除未結合的抗原。然后，加入一抗，一抗與抗原結合。接著，加入酶標記的二抗，二抗與一抗結合。最后，加入底物溶液，酶催化底物發生顏色變化，顏色變化的程度與樣本中抗原的含量成正比。


  優缺點分析:

  1.優點:

• 降低成本：可以利用同一物種的多種一抗，并使用相同的標記二抗進行檢測，降低實驗成本和工作量。

• 提高靈敏度：由于一抗未被標記，可以保持其天然的免疫活性，提高檢測的靈敏度。此外，高密度的二抗標記能夠放大信號，進一步提高檢測靈敏度。

  2.缺點:

• 存在交叉反應：二抗可能與其他抗體發生交叉反應，導致非特異性信號，降低檢測結果的準確性。

• 延長實驗時間：間接ELISA需要額外的孵育步驟，增加了實驗時間。

  在間接ELISA法中，為了避免存在交叉反應，要注意：

  1、選擇高純度的二抗：高純度的二抗可以降低雜質抗體存在的可能性。

  2、選擇對一抗具有高度特異性的二抗：這樣可以確保二抗只與一抗結合，而不會與其他抗體結合。

  3、進行對照實驗：在進行ELISA實驗時，需要設置對照組，排除二抗的交叉反應造成的假陽性結果。

  夾心ELISA

  夾心ELISA需要使用兩對抗體，分別識別抗原的不同表位，而且這兩個表位不能重疊。首先，將捕獲抗體固定在反應板的孔中。然后，加入待測樣本，如果樣本中含有待測抗原，抗原就會與捕獲抗體結合。接著，加入酶標記的檢測抗體，它能夠識別與捕獲抗體結合的抗原。最后，加入底物溶液，酶催化底物發生顏色變化，顏色變化的程度與樣本中抗原的含量成正比。


  優缺點分析:

  1.優點:

• 高特異性：由于使用兩種針對同一抗原不同表位的抗體，夾心ELISA具有很高的特異性，可以有效地識別并檢測目標抗原。
• 適用范圍廣：夾心ELISA適用于復雜或粗/不純的樣品，無需對抗原進行預處理，可以直接進行檢測。
• 靈敏度高：夾心ELISA的靈敏度較高，可以檢測微量的抗原。

  2.缺點:

• 需要定制開發抗體：如果市面上沒有現成的配對抗體，就需要定制開發，這會增加時間和成本。

  競爭ELISA

  競爭性ELISA是一種用于測量樣本中抗原或抗體濃度的免疫學檢測方法，特別適用于檢測小分子抗原或抗體。它的原理是：將待測樣本中的抗原或抗體與已知濃度的標記抗原或抗體（參考物質）進行競爭性結合，競爭結合到固相載體上的抗體或抗原。樣本中的抗原或抗體濃度越高，與標記參考物質競爭結合的量就越少，最終產生的信號強度就越弱。

  優缺點分析:

  競爭性ELISA可以基于直接ELISA、間接ELISA或夾心ELISA的檢測方法，因此其優缺點也與所選用的檢測方法有關。

  1.優點:

• 高靈敏度：可以檢測微量的抗原或抗體。
• 適用于小分子抗原或抗體：可以檢測無法直接捕獲或檢測的小分子抗原或抗體。

  2.缺點:

• 操作復雜：需要額外的步驟來進行競爭性結合反應。
• 需要嚴格的質量控制：需要確保參考物質的濃度和質量穩定。

  ELISA優缺點

  酶聯免疫吸附試驗由EvaEngvall和PeterPerlmann于1971年首次描述，是一種廣泛使用的分析生物化學實驗。與其他免疫測定程序相比，ELISA具有許多優點：

  1、由于其出色的敏感性和特異性而被經常使用。

  2、與放射免疫分析(RIA)測試等其他程序相比，ELISA的準確性更高。

  3、最常見的ELISA檢測形式是96孔微孔板。大多數ELISA微孔板都有分開的孔，必要時可以進行小規模的檢測。主要優點是一次檢測可以進行96次測定，結果通常在3小時內即可得出。這是一種省時且經濟的方法。

  4、ELISA不需要使用放射性同位素或昂貴的輻射計數器。只需要精確的微量移液器、培養箱、清洗系統和微孔板分光光度計讀數器。

  ELISA缺點：

  ELISA中對免疫原性抗原的抑制不足會導致錯誤結果。

  由于抗體是蛋白質，因此必須冷藏運輸和儲存。

  ELISA制備抗體需要大量時間且成本高昂。

  其中出現假陽性和假陰性的概率很高。

  ELISA抗體存在不穩定性。

  ELISA實驗步驟

  一、實驗準備：

  1.試劑準備：

  IL-1βELISA試劑盒（包含：包被抗體、檢測抗體、酶結合物、標準品、底物溶液、終止液、洗滌液等）

  PBS緩沖液(pH7.4)

  蒸餾水

  微量移液器

  吸頭

  酶標板

  酶標儀

  孵育箱

  洗板機(可選)

  離心機(可選)

  2.樣本準備：

  采集需要檢測IL-1β的樣本，例如血清、血漿、細胞培養上清液等。

  按照試劑盒說明書的要求處理樣本，例如離心去除細胞碎片、稀釋等。

  準備好空白對照、標準品和樣本。

  3.實驗器材準備：

  準備合適的酶標板，通常為96孔板。

  準備移液器、吸頭、孵育箱、洗板機、酶標儀等實驗器材。

  二、實驗步驟：

  1.包被：

  將試劑盒中的包被抗體(捕捉抗體)稀釋至合適的濃度，并按照說明書的要求加入到酶標板孔中。

  將酶標板置于4℃冰箱過夜或37℃孵育2小時，使抗體牢固地吸附在酶標板上。

  用洗滌液洗滌酶標板3次，去除未結合的抗體。

  2.封閉：

  將試劑盒中的封閉液加入到酶標板孔中，并按照說明書的要求進行孵育(通常為37℃1小時)。

  封閉液可以阻止酶標板表面非特異性結合，減少實驗誤差。

  用洗滌液洗滌酶標板3次，去除未結合的封閉液。

  3.加樣：

  加入標準品、樣本和空白對照(空白對照通常只加入緩沖液，不加樣本)到酶標板孔中，每個孔的體積通常為100μL。

  按照說明書的要求進行孵育(通常為37℃1小時)。

  4.洗滌：

  用洗滌液洗滌酶標板3次，去除未結合的物質。

  5.加入酶結合物：

  將試劑盒中的酶結合物(通常為酶標記的檢測抗體)稀釋至合適的濃度，并加入到酶標板孔中。

  按照說明書的要求進行孵育(通常為37℃1小時)。

  6.洗滌：

  用洗滌液洗滌酶標板3次，去除未結合的酶結合物。

  7.加入底物溶液：

  將試劑盒中的底物溶液加入到酶標板孔中，并按照說明書的要求進行反應(通常為室溫避光孵育15-30分鐘)。

  酶催化底物發生顯色反應，產生顏色變化。

  8.終止反應：

  加入終止液(通常為酸性溶液)，終止顯色反應，防止顏色繼續加深。

  9.比色：

  用酶標儀測量各孔的吸光度值，并按照試劑盒提供的說明書進行標準曲線的制作，最終計算出樣本中IL-1β的濃度。

  10.’注意事項：

  嚴格按照試劑盒說明書進行操作，不同的試劑盒可能會有不同的操作步驟和參數。

  確保所有試劑和器材處于最佳狀態，例如試劑的有效期、酶標儀的校準等。

  注意實驗環境，例如溫度、濕度、光照等因素會影響實驗結果。

  做好實驗記錄，包括實驗日期、試劑批號、樣本信息、操作步驟、結果等，便于日后分析和追溯。

  注意實驗室安全，例如戴手套、穿實驗服、操作規范等。

  上述為大家介紹ELISA實驗原理及步驟，通過原理和步驟對ELISA有初步的認識。除此之外，在實驗中多加實踐，有助于提高實驗效果。上海通蔚實業有限公司擁有15年以上的ELISA試劑盒生產經驗，搭建了ELISA試劑盒開發和成熟抗原-抗體系統的良好平臺。可提供4000多種ELISA試劑盒，主要采用夾心法和競爭法，覆蓋3000個靶標，涉及小鼠、大鼠、牛、兔、豬等20多個種類。如需試劑盒，歡迎前來咨詢！