當(dāng)科研實(shí)驗(yàn)進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫分析時(shí)，良好的信號(hào)檢測(cè)對(duì)于研究結(jié)果的可重復(fù)性至關(guān)重要。獲得良好免疫測(cè)定結(jié)果的一種特定方法是選擇與一抗相匹配的二抗。

  但什么是一抗和二抗呢？它們?nèi)绾螏椭盘?hào)檢測(cè)？在本文中，我們向您簡(jiǎn)要介紹了免疫分析中信號(hào)檢測(cè)中常用的兩種抗體、這些抗體之間的差異，以及有關(guān)如何選擇一抗和二抗的一些有價(jià)值的提示。

  在本文中您將了解到：

•   什么是蛋白質(zhì)免疫分析？

•   什么是抗體？

•   什么是一抗和二抗？

•   一抗和二抗的主要區(qū)別是什么？

•   一抗和二抗是如何產(chǎn)生的？

•   一抗和二抗在免疫測(cè)定中如何發(fā)揮作用？

•   二抗如何產(chǎn)生視覺(jué)信號(hào)？

•   二抗如何放大信號(hào)？

•   如何選擇一抗和二抗？

  什么是蛋白質(zhì)免疫分析？

  免疫測(cè)定是使用抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)樣品中的蛋白質(zhì)、測(cè)量其濃度并研究細(xì)胞或組織樣品中的蛋白質(zhì)功能或定位的方法。

  雖然這里有幾種嚴(yán)重依賴(lài)抗體檢測(cè)的檢測(cè)技術(shù)，但我們將重點(diǎn)介紹兩個(gè)例子：酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (ELISA) 和蛋白質(zhì)印跡法。

  1.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）

  在 ELISA 中，抗體（稱(chēng)為一抗）附著在固定在固體表面（例如板中的孔）上的目標(biāo)蛋白上。二抗與該抗體-靶蛋白復(fù)合物結(jié)合，有助于檢測(cè)靶蛋白。這種類(lèi)型的測(cè)定對(duì)于檢測(cè)少量的特定蛋白質(zhì)非常有用。關(guān)于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，可以參考認(rèn)識(shí)免疫學(xué)試驗(yàn)——酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (ELISA)

  2.蛋白質(zhì)印跡法（WB）

  另一種檢測(cè)靶蛋白的方法是蛋白質(zhì)印跡法。與 ELISA 類(lèi)似，目標(biāo)蛋白固定在固體表面（本例中為膜）上。一抗檢測(cè)目標(biāo)蛋白，添加二抗檢測(cè)目標(biāo)蛋白。

  什么是抗體？

  抗體是針對(duì)入侵者（例如病毒或細(xì)菌）的免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)成分。在檢測(cè)到入侵者身上的外來(lái)物質(zhì)（稱(chēng)為抗原）后，免疫反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生針對(duì)這些抗原的抗體或免疫球蛋白以中和它們。

  抗體由四種多肽組成，具有兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈。

  抗原結(jié)合片段或Fab片段是與抗原結(jié)合的輕鏈區(qū)域。而片段可結(jié)晶區(qū)或Fc片段是附著于細(xì)胞表面的抗體結(jié)構(gòu)的尾部區(qū)域。

  根據(jù)重鏈區(qū)域，免疫球蛋白可分為以下幾類(lèi)

  1、免疫球蛋白 G (IgG)

  免疫球蛋白 G 或 IgG 有 4 條鏈，其中兩條相同的 50 kDa γ 重鏈和 25 kDa κ 或 λ 輕鏈。IgG 是人血清中最豐富的抗體。根據(jù)血清中的豐度，IgG 分為四個(gè)亞類(lèi)：IgG1、IgG2、IgG3 和 IgG4。

  2、免疫球蛋白 D (IgD)

  免疫球蛋白 D 或 IgD 具有 δ 重鏈。IgD 存在于未成熟的初始 B 細(xì)胞的表面。B 細(xì)胞是免疫細(xì)胞的一種。

  3、免疫球蛋白 E (IgE)

  免疫球蛋白 E（或 IgE）具有 ε 重鏈。IgE 與過(guò)敏反應(yīng)有關(guān)。

  4、免疫球蛋白 A (IgA)

  免疫球蛋白 A 或 IgA 具有 λ 重鏈。IgA 是一種存在于分泌物中的抗體，例如唾液、眼淚、乳汁、呼吸道和腸道分泌物。

  5、免疫球蛋白 M (IgM)

  免疫球蛋白 M 或 IgM 具有 μ 重鏈。IgM 是感染后發(fā)育中的 B 細(xì)胞產(chǎn)生的第一種抗體。

  什么是一抗和二抗？

  許多免疫測(cè)定中通常使用的兩種類(lèi)型的抗體是一抗和二抗。

  一抗：特異性結(jié)合抗原的抗體。

  二抗：與一抗結(jié)合的抗體。

  一抗和二抗都可以是單克隆或多克隆抗體。單克隆抗體和多克隆抗體可以參考：《蛋白質(zhì)免疫測(cè)定：認(rèn)識(shí)多克隆抗體和單克隆抗體》

  一抗和二抗的主要區(qū)別是什么？

  一抗和二抗之間的區(qū)別主要在于與抗原的結(jié)合。

  一抗直接與特定抗原結(jié)合。在這種情況下，它將是您實(shí)驗(yàn)中的目標(biāo)蛋白質(zhì)。二抗與一抗結(jié)合，而不是與靶抗原結(jié)合。

  在抗體生產(chǎn)過(guò)程中，用于生產(chǎn)一抗的目標(biāo)抗原和宿主物種與用于生產(chǎn)二抗的目標(biāo)抗原和宿主物種不同。

  一抗和二抗是如何產(chǎn)生的？

  初級(jí)抗體的產(chǎn)生需要一種宿主物種，例如兔子、小鼠、山羊或雞。在第一個(gè)生產(chǎn)步驟中，宿主將針對(duì)抗原進(jìn)行免疫以產(chǎn)生一抗。

  二抗的生產(chǎn)始于將來(lái)自一個(gè)特定宿主物種的一抗注射到完全不同的宿主物種中。例如，如果產(chǎn)生的抗體來(lái)自小鼠，則可以在兔、山羊或雞中產(chǎn)生二抗。

  針對(duì)整個(gè)抗體或 IgG 產(chǎn)生的二抗可識(shí)別所有 IgG 片段。它們識(shí)別輕鏈和重鏈。它們也相對(duì)便宜并且對(duì)于許多一般免疫測(cè)定有用。

  然而，它們可以結(jié)合一抗的 Fc 區(qū)和細(xì)胞上的 Fc 受體。為了提高檢測(cè)中二抗的特異性并減少交叉反應(yīng)性，您可以使用針對(duì) Fc 片段、Fab 片段或其他片段生成的特定抗體。

  例如，針對(duì) Fab 區(qū)的二抗可用于免疫沉淀后的蛋白質(zhì)印跡。這種類(lèi)型的抗體僅識(shí)別 Fab 片段，因此它們比針對(duì)整個(gè) IgG 的抗體更具特異性。因此，使用 Fab 片段特異性抗體可以避免在印跡上檢測(cè)到大小為 50 kDa 的不需要的重鏈，從而妨礙了具有相似大小的目標(biāo)蛋白的可視化。

  為了檢測(cè)靶蛋白，將產(chǎn)生信號(hào)的分子附著到一抗或二抗上是必不可少的。

  一抗和二抗在免疫測(cè)定中如何發(fā)揮作用？

  您可以使用直接或間接免疫測(cè)定來(lái)可視化抗原與一抗的結(jié)合。

  在直接免疫測(cè)定中，一抗附著在信號(hào)分子上。當(dāng)一抗與抗原結(jié)合時(shí)，這種抗原-抗體相互作用會(huì)激活信號(hào)分子，從而進(jìn)行檢測(cè)。

  在間接免疫測(cè)定中，二抗有助于檢測(cè)，因?yàn)檫@些抗體與信號(hào)分子連接。該方法的工作原理是：二抗識(shí)別與抗原結(jié)合的一抗，然后該復(fù)合物的形成激活信號(hào)分子。

  二抗如何產(chǎn)生視覺(jué)信號(hào)？

  使用二抗時(shí)，您將進(jìn)行間接免疫測(cè)定。此處，二抗與抗原結(jié)合的一抗結(jié)合。這種相互作用導(dǎo)致附著在二抗上的信號(hào)分子發(fā)出信號(hào)，或?qū)⒉豢蓹z測(cè)的底物轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)印跡上的視覺(jué)信號(hào)（Yu et al., 2015）。

  以下是信號(hào)分子的一些示例：

  放射性同位素

  可用于間接檢測(cè)的方法是使用放射性同位素標(biāo)記的二抗，例如 Iodine-125。這種放射性同位素發(fā)射帶有低能光子的伽馬射線(xiàn)，可以使用 X 射線(xiàn)膠片檢測(cè)到。

  酶

  在蛋白質(zhì)印跡中，通常使用與酶（例如辣根過(guò)氧化物）綴合的二抗。添加辣根過(guò)氧化物底物后，酶裂解無(wú)色底物并在印跡上產(chǎn)生可見(jiàn)的彩色信號(hào)。

  熒光染料

  二抗可以用熒光染料標(biāo)記，例如異硫氰酸熒光素 (FITC)、R-藻紅蛋白、羅丹明和德克薩斯紅。抗體的結(jié)合會(huì)激發(fā)特定波長(zhǎng)的熒光，并發(fā)出另一波長(zhǎng)的光。

  二抗如何放大信號(hào)？

  在間接免疫測(cè)定中，多個(gè)帶有信號(hào)分子的二抗可以與一抗分子結(jié)合。在這種情況下，使用與信號(hào)分子結(jié)合的二抗可能會(huì)導(dǎo)致信號(hào)放大（Yu et al ., 2015）。因此，間接檢測(cè)比直接免疫測(cè)定靈敏得多。

  如何選擇一抗和二抗

  了解一抗的詳細(xì)信息。例如：驗(yàn)證、產(chǎn)生抗體的宿主物種、與免疫測(cè)定的兼容性、靈敏度、成本以及對(duì)目標(biāo)蛋白的特異性。

  選擇與收集樣品的宿主物種不同的一抗宿主物種。

  確保產(chǎn)生二抗的宿主物種與產(chǎn)生一抗的宿主物種不同。

  找到能夠識(shí)別一抗的二抗。例如，小鼠一抗需要在另一個(gè)宿主物種中產(chǎn)生的抗小鼠二抗。

  選擇與一抗類(lèi)別或亞類(lèi)相匹配的二抗。如果單克隆一抗屬于小鼠 IgM 類(lèi)別，則選擇抗小鼠 IgM 二抗。當(dāng)一抗的免疫球蛋白類(lèi)別或亞類(lèi)未知時(shí)，您可以選擇抗小鼠 IgG 二抗。

  選擇特異性高且與非靶標(biāo)抗體交叉反應(yīng)性較小的二抗。