抗體是生命科學研究較為廣泛工具之一，抗體目前面臨一個問題——交叉反應。ELISA可以定量多種樣品基質（包括生物樣品）中的蛋白質，這些樣品可能需要經過一些預處理步驟，例如稀釋、裂解或純化，以去除干擾物質并優化檢測。ELISA的成功在很大程度上取決于所用抗體對的特異性和親和力。因此，驗證抗體是確保ELISA實驗準確且可重復關鍵步驟。

  抗體驗證

  抗體驗證至關重要，如下原因：

  1.特異性：確保抗體僅與目標抗原結合而不與其他蛋白質結合。

  2.靈敏度：甚至可以檢測到低濃度的抗原。

  3.可重復性：在不同的實驗和實驗室中獲得一致的結果。

  4.準確度：正確量化目標抗原。

  在之前的文章《抗體選擇：如何區分好抗體和壞抗體》提到抗體驗證的五大支柱有望提高可重復性，分別是遺傳策略、正交策略、獨立抗體策略和標記蛋白的表達等。

  檢測特異性抗體驗證

  值得注意的是，針對各種抗體檢測，樣品的制備方式不同。對于流式細胞術和ELISA，蛋白質通常為天然形式，而對于蛋白質印跡、免疫組織化學和免疫細胞化學，蛋白質則部分或完全變性。由于蛋白質構象和靶標可及性不同，在一種檢測中效果良好的抗體可能在另一種檢測中表現不佳。這種復雜性使得很難建立一個單一的基準來評估所有可能應用中的抗體性能。因此，抗體驗證方法必須根據具體應用和情況進行量身定制。

  夾心ELISA抗體驗證

  ELISA實驗檢測可溶性物質，如肽、蛋白質、抗體和激素。它們通常以“夾心”形式進行（圖）。夾心ELISA通過使用結合到ELISA板上的捕獲抗體來固定目標蛋白質，同時檢測抗體產生讀出信號來識別分析物。與間接形式相比，使用抗體對可顯著提高夾心ELISA的特異性和靈敏度，而抗體驗證是確保準確和可重復結果的關鍵步驟。

  尋找并驗證ELISA抗體對

  1.了解目標蛋白

  a.蛋白質結構：抗體對與抗原表面的互補表位結合。必須了解靶蛋白的天然確認，以探索單個表位作為抗體靶標的適用性。

  b.生物相關性：考慮您正在研究的生物環境中目標蛋白質的作用和表達。

  c.翻譯后修飾(PTM)、異構體和裂解產物：注意任何可能影響抗體結合的修飾。

  2.包括適當的控制

  a.表達確認：確保目標蛋白質在所選樣本中表達。

  b.對照：使用陽性和陰性對照來驗證抗體特異性。

  3.抗體驗證

  確保公司驗證數據是在與您要求的相同樣品類型中進行的，因為基質效應可能會干擾抗體結合。您可以使用加標和回收率以及稀釋線性來測試樣品類型中抗體對的適用性。

  如果需要，請按照抗體驗證的五大支柱進行進一步驗證。

  4.確定最佳抗體濃度

  進行棋盤滴定以確定捕獲和檢測抗體的最佳濃度。

  ELISA檢測驗證

  為了驗證用于測量生物流體中分析物濃度的ELISA方法，根據Andreasson等人在論文“免疫測定方法驗證實用指南”中描述的指導原則，建議執行以下步驟：

  精度：重復測量的接近程度的度量

  1.運行內精度：在一次運行中分析至少兩個樣品（一個高濃度，一個低濃度）的多個重復樣品。

  2.運行間精度：分析不同運行和日期內同一樣品的多次重復實驗。

  靈敏度：通過分析已知低濃度的樣品確定定量限(LOQ)。LOQ是可以以可接受的精度和準確度可靠地定量分析物的最低濃度。

  基質效應是指基質中存在的物質產生的干擾。可以通過稀釋樣品來減少基質效應。可以通過在樣品中加入目標分析物并分析回收率來檢查基質效應。

  蛋白質穩定性：評估樣品中分析物在不同儲存條件下（例如室溫、4°C、-20°C）以及多次凍融循環后的穩定性。這對于避免與樣品采集和儲存相關的系統誤差非常重要。

  交叉反應測試：測試抗體與一組相關蛋白質的交叉反應。此步驟可確保抗體對目標抗原具有特異性，并且不會與其他蛋白質上的類似表位結合。Blast®等工具在此過程中非常有用。

  ELISA故障排除

  盡管經過嚴格驗證，ELISA過程中仍可能出現一些問題。以下是常見問題及其潛在解決方案：

  1.非特異性結合

  問題：背景信號高或非特異性結合。

  解決方法：優化阻斷條件和洗滌步驟。

  2.低靈敏度

  問題：目標抗原檢測不佳。

  解決方案：檢測前30分鐘將所有試劑放置于室溫下，以一定角度移液，不要接觸孔底，對樣品進行連續稀釋，使其處于可檢測范圍內

  3.結果不一致

  問題：重復或測定之間的差異性。

  解決方案：標準化協議，確保試劑質量的一致性（例如，批次間差異），并保持嚴格的環境控制（例如，溫度）。

  抗體驗證是ELISA開發的關鍵組成部分，可確保檢測結果的可信度。通過遵循特定應用的驗證策略并遵守既定指南，研究人員可以顯著提高實驗結果的可靠性。