“凡事預則立，不預則廢”。做ELISA實驗也是如此，在進行ELISA實驗時要做足充分準備。那么，在平時實驗室做ELISA實驗要注意哪些問題呢？下面通蔚帶您從ELISA實驗準備、標準品溶解、洗滌和標準線擬合及常見問題等方面進行闡述。

  ELISA操作前準備

  1、試劑盒選擇。在進行ELISA操作前，應做好實驗設計，并根據樣本類型、物種、檢測范圍、靈敏度、信譽度以及成本等因素選擇合適的ELISA試劑盒。同時，需要提前訂購試劑盒和相關耗材，并根據說明書準備樣本、稀釋樣品、做好充分準備工作。

  2、樣本處理。樣本制備是進行ELISA實驗前較為關鍵一步。標本提倡新鮮的標本進行檢測，尤其是對于當天收集的檢測標本，即使暫時不用，建議分裝在后在4℃保存，在4℃保存建議不要超過72小時。如需長期保存，應將標本分裝成小份后放在-20℃或-70℃條件下保存。標本切記反復凍融，室溫和冰箱存在一定溫差，蛋白質極易降解，直接影響實驗質量。

  Elisa標準品溶解

  標準品是已知濃度的代測物質，用于建立標準曲線，從而推算出未知樣品中待測物質的濃度。因此標準品溶解、倍比稀釋和保存等細節要特別注意。操作標準品時需格外小心，注意以下細節：

  1.復溶：根據試劑盒說明書的要求，使用正確的復溶液，并使用移液槍緩慢地將復溶液加入凍干粉中，避免產生氣泡。輕輕旋轉或拍打管壁，使凍干粉充分溶解。靜置5-10分鐘后，短暫離心，收集管壁和蓋子上的液體。

  2.分裝和保存：將復溶后的標準品根據一次用量分裝成小份，避免反復凍融。-70℃保存更適合長期儲存，-20℃則更適合短期儲存(具體儲存溫度和時間請參考試劑盒說明書)。

  3.稀釋：準備干凈的離心管并進行編號，根據試劑盒說明書選擇合適的稀釋液。在獨立的管子中進行系列稀釋，避免在ELISA板內進行過多的倍比稀釋步驟。稀釋時，使用移液槍準確吸取，并輕輕顛倒混勻，避免劇烈震蕩。建議使用進口或硅化的EP管，以減少蛋白質吸附。

  4.加入到ELISA板中：使用移液槍將稀釋好的標準品加入到ELISA板的相應孔中，注意槍頭不要刮劃孔底。

  5.穩定性：標準品復溶后的穩定性取決于具體的試劑盒，請仔細閱讀試劑盒說明書，并在規定的時間內使用。

  ELISA操作中的洗滌

  洗滌是ELISA操作步驟中至關重要，如果洗滌不當，會導致背景值高、假陽性結果以及實驗重復性差等問題。 因此，必須嚴格按照試劑盒說明書規定的步驟、體積、時間和次數進行洗滌操作，例如使用多道加樣器、吸管或洗板機等。下面通蔚為大家整理一些洗板小貼士，大家可以對照了解自己洗板操作是否正確。

  1、洗滌液不要溢出孔。在ELISA洗滌過程，洗滌液溢出孔容易交叉污染相鄰的孔，容易造成背景高，從而影響實驗準確性，尤其是在前兩次洗滌時，由于孔中殘留的未結合的抗體或抗原濃度較高，溢出后更容易污染相鄰孔，導致假陽性信號。

  2、設置實驗考慮孔位置。為了減少潛在的交叉污染，建議將空白孔、低濃度標準品孔和陰性對照組放置在ELISA板的邊緣或單獨的區域。這樣可以盡量避免這些孔受到高濃度樣本或標準品的影響。

  正確的甩板方式對于減少交叉污染至關重要。甩板時，應將ELISA板傾斜，使液體流向一側，然后在干凈的吸水紙上輕拍，以吸干殘留液體。避免旋轉甩板，因為這樣容易造成液體殘留和飛濺，增加交叉污染的風險。輕微的抖動可以幫助去除殘留液體，但要確保液體不會飛濺到其他孔中。

  除了孔位置和甩板方式外，其他操作步驟也可能導致交叉污染。例如，加樣時應避免槍頭接觸孔壁，洗滌時應避免洗滌液溢出。應嚴格按照試劑盒說明書進行操作，并采取必要的預防措施，以最大程度地減少交叉污染的風險。最終的孔設置請參考所用試劑盒的說明書。

  3、用干凈的濾紙，不要用衛生紙。ELISA洗板后，拍干殘留液體是至關重要的步驟。為了避免污染和干擾實驗結果，強烈建議使用干凈的無塵紙或專用ELISA板吸水紙，而不是普通的衛生紙。

  4、衛生紙通常含有細小的纖維和粉塵，這些物質容易脫落并粘附到孔中。這些污染物會干擾后續的反應，導致背景值升高或吸附待測物質，從而導致結果偏低或不準確。此外，衛生紙的吸水性也可能不如無塵紙或專用吸水紙，導致液體殘留，影響實驗結果的重復性。

  5、正確的拍干方式是將ELISA板倒扣在干凈的吸水紙上，并輕輕拍打板底，確保每個孔都充分接觸吸水紙，以吸干殘留液體。避免重復使用吸水紙，以防止交叉污染。使用干凈且合適的吸水材料對于確保ELISA實驗結果的準確性和可靠性至關重要。

  ELISA標準曲線擬合

  ELISA標準曲線擬合是ELISA實驗數據分析的關鍵步驟。一般情況下，應優先按照試劑盒說明書推薦的擬合方法進行操作。雖然部分酶標儀可自動生成標準曲線，也可手動制作，但推薦使用酶標儀配套軟件或專業數據處理軟件進行擬合，以提高效率和減少人為誤差。

  ELISA標準曲線通常呈“S”形，兩端趨于水平，中間近似線性。中間的線性部分是最佳檢測范圍，靈敏度和準確度最高。由于抗原抗體反應的飽和效應，當標準品濃度超過一定值后，即使繼續增加濃度，OD值也不再顯著變化，曲線趨于水平。廠商提供的推薦濃度范圍通常落在近似線性區域，但不一定完全在S形的正中間。

  根據標準曲線，可以計算待測樣本的濃度。然而，如果數據中存在“奇異點”（偏離整體趨勢的異常數據點）或“污點”（由于操作誤差，例如加樣錯誤、污染等導致的無效數據點），直接進行線性擬合或其他擬合可能會導致結果不準確。出現這種情況時，需要仔細檢查實驗操作，找出異常值出現的原因。如果確定是操作誤差導致的“污點”，則可以剔除該數據點；如果是由于其他原因導致的“奇異點”，則需要謹慎考慮是否剔除，并根據具體情況選擇合適的處理方法。

  除了線性擬合，還可以采用其他擬合方法，例如雙對數擬合和四參數邏輯回歸(4PL)擬合。4PL擬合通常是ELISA數據處理中最常用的非線性擬合方法，因為它能更準確地描述S形曲線，尤其是在曲線兩端非線性較強的情況下。一些軟件還允許使用不同的權重，例如1/Y或1/Y2加權，以提高低濃度區域的擬合精度。選擇哪種擬合方法以及是否使用權重，需要根據試劑盒說明書、數據的特點和分析目的進行判斷。

  上述是做ELISA實驗要注意的問題，掌握上述ELISA注意事項，保證ELISA實驗順利進行至關重要。希望本文指導可以幫助您在未來實驗中取得成功。