在酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）中有多種ELISA類型，其中較為常見的是直接和間接ELISA類型，這兩種類型大多數(shù)人往往會容易混淆，尤其是對于新手來說。今天上海通蔚針對這個問題寫一篇直接和間接ELISA區(qū)別，對于剛拿到ELISA試劑盒實驗人員選擇那種檢測類型至關(guān)重要。

圖1 elisa類型

  直接ELISA

  直接ELISA的主要優(yōu)勢在于其操作步驟簡單、快速，并且在使用高特異性抗體的情況下，由于省去了二抗，可以減少由二抗帶來的非特異性結(jié)合及潛在的交叉反應(yīng)。它使用直接偶聯(lián)了酶標(biāo)記的一抗與目標(biāo)抗原結(jié)合。然而，直接ELISA的靈敏度通常較低，因為它缺乏信號放大步驟。每個抗原分子最多只能結(jié)合一個標(biāo)記的抗體，不像間接ELISA那樣，一個一抗可以結(jié)合多個標(biāo)記的二抗，從而實現(xiàn)信號放大。因此，直接ELISA在檢測低豐度抗原方面可能存在困難。此外，直接ELISA需要為每個目標(biāo)抗原制備一種特異的酶標(biāo)記抗體，這限制了它的應(yīng)用范圍。

  雖然直接ELISA的應(yīng)用范圍不如間接ELISA廣泛，但在特定情況下，例如快速檢測、高豐度抗原檢測以及需要減少潛在交叉反應(yīng)性的場合，它仍然是一個有價值的工具。

  間接ELISA

  間接ELISA的主要優(yōu)勢在于其高靈敏度。由于二抗可以與一抗上的多個位點結(jié)合，從而實現(xiàn)信號放大，使得即使在樣本抗原含量較低的情況下也能有效檢測。此外，間接ELISA具有很高的靈活性，因為可以使用各種不同標(biāo)記的二抗與同一一抗配對，以適應(yīng)不同的檢測需求和平臺，無需重復(fù)標(biāo)記一抗。例如，研究人員可以根據(jù)實驗需要選擇酶標(biāo)、熒光標(biāo)記或其他類型的二抗。

  然而，間接ELISA也存在一些缺點。其中最主要的缺點是存在潛在的交叉反應(yīng)性。這是因為二抗可能與樣品中除目標(biāo)抗原以外的其他蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合，或者使用的二抗本身特異性不高，從而導(dǎo)致假陽性結(jié)果。因此，選擇高質(zhì)量、高特異性的二抗對于減少交叉反應(yīng)至關(guān)重要。

  檢測抗體

  抗體在許多生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中起著至關(guān)重要的作用，例如ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）。ELISA利用抗體與目標(biāo)抗原特異性結(jié)合的特性來檢測和定量樣品中的抗原或抗體。ELISA的基本原理是將抗原或抗體固定在固相載體上，然后加入樣品和標(biāo)記的抗體（或抗原）。在ELISA中，根據(jù)不同的實驗設(shè)計，可以使用直接標(biāo)記的抗體（直接ELISA）或未標(biāo)記的一抗和標(biāo)記的二抗（間接ELISA等）。

  在直接ELISA中，檢測抗體預(yù)先標(biāo)記有報告酶，如辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(ALP)。當(dāng)標(biāo)記抗體與抗原結(jié)合后，加入底物會引發(fā)酶促反應(yīng)，產(chǎn)生可檢測的信號，例如顏色變化或化學(xué)發(fā)光。在一定濃度范圍內(nèi)，該信號的強度與樣品中抗原的濃度成正相關(guān)。

  為了確保ELISA結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，需要使用高度特異性的抗體，以最大限度地減少交叉反應(yīng)和非特異性結(jié)合，從而降低假陽性率。制備高特異性抗體需要精心設(shè)計和嚴(yán)格的質(zhì)量控制。此外，ELISA的操作步驟，例如包被、洗滌和孵育，也需要嚴(yán)格控制，以確保結(jié)果的可靠性。

  常見問題解答

  1.夾心ELISA與直接和間接ELISA有何不同？

  夾心ELISA使用兩種針對目標(biāo)抗原不同表位的抗體：一種未標(biāo)記的“捕獲”抗體包被在板上，用于捕獲抗原；另一種標(biāo)記的“檢測”抗體用于檢測結(jié)合到捕獲抗體的抗原。與直接或間接ELISA將抗原直接包被在板上不同，夾心ELISA通過兩種抗體的協(xié)同作用來提高特異性和靈敏度，尤其適用于復(fù)雜樣品中低濃度抗原的檢測。

  2.間接ELISA是否使用多種類型的抗體？

  是的。間接ELISA使用兩種抗體：一種未標(biāo)記的“一抗”用于特異性結(jié)合目標(biāo)抗原，一種標(biāo)記的“二抗”用于檢測結(jié)合到抗原上的一抗。二抗是針對一抗物種來源的抗體，例如如果一抗是小鼠來源的，就需要使用抗小鼠的二抗。

  3.哪種ELISA更準(zhǔn)確？

  ELISA檢測的準(zhǔn)確性取決于多種因素，包括抗體的特異性和親和力、試劑的質(zhì)量、操作的規(guī)范性以及具體的檢測方案。一般而言，夾心ELISA由于使用了兩種抗體，通常比直接和間接ELISA具有更高的特異性和靈敏度。直接ELISA的步驟較為簡單，但靈敏度較低，更適用于高濃度抗原的檢測。間接ELISA的靈敏度較高，但也更容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)。選擇哪種ELISA方法需要根據(jù)具體的實驗需求和目標(biāo)抗原的特性來決定。

  間接ELISA使用兩種抗體：一種未標(biāo)記的一抗特異性識別并結(jié)合目標(biāo)抗原，另一種是標(biāo)記的二抗，用于檢測結(jié)合了抗原的一抗。

  與直接ELISA相比，間接ELISA可以顯著放大信號并提高靈敏度，因為多個二抗分子可以結(jié)合到一個一抗分子上，從而產(chǎn)生更強的信號。然而，間接ELISA的操作步驟比直接ELISA更復(fù)雜，需要額外的二抗孵育和洗滌步驟，因此孵育時間也更長。

  總而言之，直接和間接ELISA各有優(yōu)缺點。直接ELISA操作簡便、快速，但靈敏度較低。間接ELISA靈敏度高，但操作步驟更復(fù)雜，耗時更長，且存在潛在的交叉反應(yīng)風(fēng)險。選擇哪種方法取決于具體的實驗需求和目標(biāo)。為了確保ELISA檢測的準(zhǔn)確性，需要仔細優(yōu)化各種實驗條件，包括選擇高特異性和高親和力的抗體、合適的封閉劑、優(yōu)化的洗滌方案以及合適的底物和酶標(biāo)讀數(shù)儀等。