ELISA（酶聯免疫吸附實驗）是一種利用特異性抗體（抗原）反應將目標抗原（抗體）結合在固相載體上，并利用酶標記的抗體（或抗原）進行檢測，并根據顯色反應的強弱來定量樣品中目標物質的含量。它是一種利用抗原抗體特異性結合進行免疫反應的定性和定量檢測方法，目前廣泛應用生物學、醫學等多種研究領域。

  ELISA實驗原理

  在ELISA中，將已知的抗原或抗體結合在固相載體表面，然后利用酶標記（偶聯）的抗體或抗原與之孵育，測量加入底物后形成的產物的光吸收并將其轉換為數值來進行定性和定量分析。如果對定性和定量分析不是很理解，可以參考這篇文章《ELISA檢測試劑盒：定性與定量分析的優勢比較》。根據抗原抗體結合，該檢測方法分為直接ELISA、間接ELISA、夾心ELISA法和競爭ELISA法等。

  直接ELISA法

  原理：將目標蛋白（或目標抗體）固定在酶標板上，與針對該目標蛋白的酶標記抗體（或針對該目標抗體的特異性抗原）一起孵育，洗滌后，測量微孔板孔結合酶的活性。

  間接ELISA法

  原理：將目標蛋白（或目標抗體）固定在酶標板上，隨后分兩步來進行檢測，先加入檢測抗體或抗原進行特異性結合。其次再加入酶標二抗檢測并利用底物顯色。

  夾心ELISA法

  原理：將針對目標蛋白的抗體固定在酶標板，先與目標蛋白孵育，然后與另一種用酶標記的目標蛋白特異性抗體孵育。清洗后，測量微孔板孔結合酶的活性。

  競爭ELISA法

  原理：將針對特定目的蛋白的抗體固定在酶標板，與含有目的蛋白的樣品以及已知量的酶標記的目的蛋白一起孵育，反應結束后，測量微孔板孔結合酶的活性。

  當樣品中的抗原水平較高時，抗體結合的酶標抗原水平較低，顏色較淺。相反，當抗原水平較低時，抗體結合的酶標抗原水平較高，顏色較深。

  上述是ELISA實驗原理步介紹，上述4種ELISA法檢測原理有區別，在進行ELISA實驗時候，結合自己檢測目標及實驗需求進行選擇。如果想了解更多ELISA法區別，本篇幅有限，可以參考這篇文章《酶聯免疫試劑盒常見5種實驗檢測方法》。接下來以夾心法為列，詳細介紹下ELISA實驗步驟。

  1、試劑和設備的準備

  2、抗體的固定化

  將稀釋后的抗體加入96孔ELISA板的每個孔中，密封板以防止蒸發，并在4°C下孵育15-18小時以固定抗體。

  3、洗滌

  除去稀釋的抗體，用洗滌液洗滌3次。

  4、封閉

  向每個孔中添加封閉緩沖液，并讓其在37°C下孵育1小時，以減少目標蛋白與孔的非特異性結合。

  5、洗滌

  除去封閉緩沖液，用洗滌液洗滌3次。

  6、樣品添加

  用樣品稀釋緩沖液稀釋樣品，并將每個樣品100μL添加到每個孔中。為制作校準曲線，在同一板上準備標準品的一系列稀釋液。將其在37°C下孵育1小時。

  7、洗滌

  取出樣品，用洗滌液洗滌5次。

  8、檢測抗體的添加

  用樣品稀釋緩沖液稀釋檢測抗體，每孔加入100μL，

  37°C孵育1小時。

  9、洗滌

  反應結束后，去除檢測抗體，用洗滌液洗滌5次。

  10、酶標二抗的添加

  用樣品稀釋緩沖液稀釋酶標二抗，每孔加入100μL，

  37℃孵育1小時。

  11、洗滌

  反應結束后，除去二抗，用洗滌液洗滌5次。

  12、添加底物溶液。

  孵育直至顏色顯現。

  13、用讀板器測量450nm處的吸收率。