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產(chǎn)品及特點
立克次氏體（Rickettsia spp.）是一類嚴格細胞內(nèi)寄生的原核細胞型微生物,有3個屬，10個種，其中的Rickettsia prowazekii（普氏立克次氏體）、Rickettsia mooseri（現(xiàn)名Rickettsia typhi，莫氏立克次體）和Orientia tsutsugamushi（恙蟲病東方體）等種可導(dǎo)致人類流行性斑疹傷寒、地方性斑疹傷寒、恙蟲病、Q熱、斑點熱等傳染病，因此快速檢測立克次氏體具有重要意義。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測立克次氏體的試劑盒，它具有下列特點：
立克次氏體（Rickettsia spp.）是一類嚴格細胞內(nèi)寄生的原核細胞型微生物,有3個屬，10個種，其中的Rickettsia prowazekii（普氏立克次氏體）、Rickettsia mooseri（現(xiàn)名Rickettsia typhi，莫氏立克次體）和Orientia tsutsugamushi（恙蟲病東方體）等種可導(dǎo)致人類流行性斑疹傷寒、地方性斑疹傷寒、恙蟲病、Q熱、斑點熱等傳染病，因此快速檢測立克次氏體具有重要意義。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測立克次氏體的試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達到100拷貝/反應(yīng)。
3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據(jù)立克次氏體DNA高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他細菌的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 涵蓋性廣，尤其是能檢查危害人類健康的幾種立克次氏體。
6. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5個數(shù)量級。
7. 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應(yīng)。
8. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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2×Probe qPCR MasterMix |
500μL |
0.5mL本色管 |
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熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL |
1.5mL綠蓋管 |
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超純水 |
1mL |
1.5mL紫蓋管 |
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立克次氏體qPCR引物-探針混合液干粉 |
50次 |
0.5mL棕色管 |
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立克次氏體qPCR陽性對照(1×10E7拷貝/μL) |
50μL |
0.5mL黃蓋管 |
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使用手冊 |
1份 |
無 |
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本產(chǎn)品采用五孔盒包裝 |
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注 意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入165mL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀釋標準曲線樣品以10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例
稀釋標準曲線樣品以10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。
1. 標記6個離心管，分別為6，5，4，3，2，1。
2. 用帶芯槍頭分別加入45μL熒光PCR專用模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
3. 在6號管中加入5μL1×10E7拷貝/μL的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號管中加入5μL1×10E6拷貝/μL的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號管中加入5μL1×10E5拷貝/μL的陽性對照(上步所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
樣品DNA的制備
7. 如果有N個樣品，設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL上步所得4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。
8. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)樣品DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。
Probe qPCR反應(yīng)20μL體系，在樣品制備室進行
9. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù)，則標記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（直接用第6步第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數(shù)據(jù)處理
1. 如果擴增陽性對照或制備陽性對照結(jié)果為陰性，則整個擴增或制備實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重做擴增或制備或跟廠家聯(lián)系。如果擴增陰性對照或制備陰性對照結(jié)果為陽性，說明環(huán)境污染，則整個擴增或制備實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系，購買新的引物和探針。
2. 如果陰性對照和陽性對照正常，則實驗有效，可以進入后續(xù)分析。
3. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，分別以陽性對照（FAM通道）和（HEX通道）的Ct值為縱軸，繪制標準曲線，陽性對照的標準曲線為斜線，r2必須大于0.95。再以待測樣品的Ct值從陽性對照的標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
4. 對定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照FAM通道的Ct必須大于或等于40。陽性對照FAM通道的熒光信號必須有對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于35。對待測樣品，如果其FAM通道的Ct大于或等于40則為立克次氏體陰性，如果小于或等于35則為立克次氏體陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。
自備試劑
超純水，樣品DNA
超純水，樣品DNA
運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存，有效期2年
低溫運輸，-20℃保存，有效期2年
