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品質保證 · 通蔚試劑

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產品中心

  • 支原體通用探針法qPCR試劑盒

    規格:
    • 品牌 : 通蔚生物
    • 目錄號 : TW-E10596
    • 應用 : 僅限于科研使用
    • 貨期 : 2年
    • 規格 :50T
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產品及特點

支原體屬(Mycoplasma spp.)是支原體目、支原體科的1屬,有近百個種。它們是一類沒有細胞壁、高度多形性、能通過濾菌器、可用人工培養基培養增殖的原核細胞型微生物,大小為 0.1~0.3 微米。由于能形成絲狀與分枝形狀,故稱為支原體。支原體廣泛存在于人和動物體內,大多不致病。但是它們常常污染培養細胞,污染發生率高達到50%左右,故培養細胞的支原體污染已經成為一個世界性的難題。由于當細胞(特別是傳代細胞)被支原體污染后,細胞內的DNA、RNA及蛋白表達發生改變,而細胞的生長率一般并未發生顯著的影響,故難以察覺,因此在早期快速診斷具有重要的意思。歐盟藥典已經要求對使用培養細胞流程生產的生物工程制品進行 9 種支原體的核酸檢測。為此本公司開發了涵蓋歐盟所要求的9種支原體檢測試劑盒,它具有下列特點:

1. 即開即用,用戶只需要提供樣品DNA模板。
2. 引物和探針經過優化,分析靈敏性高,可以達到100拷貝/反應。
3. 提供陽性對照,便于區分假陰性樣品。
4. 特異性高,引物是根據支原體通用DNA高度保守區設計,不會跟其他生物的DNA發生交叉反應。
5. 能檢測出至少30種常見的支原體,其中包括歐盟所要求的9種,它們是萊氏無膽甾原體(Acholeplasma laidlawii)、發酵支原體(M.fermentans)、豬鼻支原體(M. hyorhinis)、口腔支原體(M. oral)、精氨酸支原體(M. arginini)、肺炎支原體(M. pneumonia)、雞毒支原體(M. gallisepticum)、滑液支原體(M. synoviae)和螺原體(Spiroplasma citri)。
6. 既可用于定性檢測,又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5個數量級。
7. 本產品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應。
8. 本產品只能用于科研。

規格及成分

成分

規格

包裝

2×Probe qPCR MasterMix

0.5mL

0.5mL本色

熒光PCR專用模板稀釋液

1mL

1.5mL綠蓋管

超純水

1mL

1.5mL藍蓋管

支原體通用qPCR引物-探針干粉

50次

1.5mL棕色管

支原體通用qPCR陽性對照(1×10E7拷貝/μL)

50μL

0.5mL黃蓋管

使用手冊

1份

1份

本產品采用五孔盒包裝

意: 引物-探針干粉在使用前需要短暫離心,然后在離心管中加入162uL的超純水充分混勻后再使用,未用完的需要-20℃保存。


使用方法

稀釋標準曲線樣品以10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例
由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原,本產品不提供活體樣品做陽性對照,只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。
1. 標記6個離心管,分別為6,5,4,3,2,1。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液,用帶芯槍頭,下同)。
3. 在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),充分震蕩1分鐘,得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭,在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用
5. 換槍頭,在4號管中加入5 μL 1×10E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E4拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用
6. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

樣品DNA的制備
7. 如果有N個樣品,設置N+2個提取,多出的一個是PC(樣品制備陽性對照),一個是NC(樣品制備陰性對照)。可以用10μL上步所得4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟核酸制備試劑盒所要求的起始樣本體積一樣,以此作為PC。另外用水作為NC。
8. 用自選方法純化樣品的DNA,本試劑盒跟市場上大多數樣品DNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。
Probe qPCR反應20 μL體系,在樣品制備室進行
9. 如果做定量分析并且只做1次重復,則標記N+9個PCR管,其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,1個用于PCR陰性對照(用水做模板),6個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做1次重復,則標記N+4個PCR管,其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,1個用于PCR陰性對照(用水做模板),1個用于PCR陽性對照(直接用第6步第4號管的陽性對照稀釋液做模板)。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

數據處理
1. 如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的log值為橫軸,以Ct值為縱軸,繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值,再推算出其濃度。
2. 如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照必須無Ct或Ct大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長,有典型擴增曲線,Ct值應該小于40,否則實驗無效。如果實驗有效,則分析待測樣品,如果無Ct或Ct大于或等于40,則為陰性。如果Ct小于40則為陽性。

自備試劑
樣品DNA
運輸及保存
低溫運輸,-20℃保存,有效期2年
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