產品及特點
本產品是以探針法熒光定量PCR技術為基礎開發的專門檢測鴿痘病毒（Pigeon- -pox Virus，PGPV）的試劑盒。鴿痘病毒屬于痘病毒科脊椎動物痘病毒亞科成員，為雙鏈DNA病毒，基因組長度為260 kb～365 kb。鴿痘病毒感染鴿可引起鴿痘，鴿痘是一種具有較強傳染性的病毒性疾病，發病癥狀為體表皮膚、眼瞼邊緣、口腔黏膜、腳爪等部位出現痘疹，是危害商品鴿養殖的一種重要傳染病，可引起產蛋下降和死亡。 鴿痘一年四季均可發生，在夏季蚊子多的季節盛行，各種品種、性別和年齡的鴿均可感染，但以乳鴿和青年鴿發病，1歲以內幼鴿病死率為5％～60％。鴿痘病毒感染給商品鴿養殖帶來巨大危害，快速檢測鴿痘病毒具有重要意義。為此本公司開發了鴿痘病毒探針法qPCR試劑盒。本產品具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。
2. 引物和探針經過優化，靈敏度高，檢測限可達100拷貝/反應。
3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據鴿痘病毒基因組DNA高度保守區設計，不會跟其它生物的DNA發生交叉反應。
5. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時，線性范圍至少5個數量級。
6. 本產品足夠50次20 μL體系的探針法熒光定量PCR反應。
7. 本產品只能用于科研。
規格及成分
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成分
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規格
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包裝
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2×Probe qPCR MasterMix
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500μL
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0.5mL本色蓋
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熒光PCR專用模板稀釋液
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1mL
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1.5mL綠蓋管
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超純水
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1mL
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1.5mL藍蓋管
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鴿痘病毒qPCR引物-探針干粉
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50次
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0.5mL棕色管
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鴿痘病毒陽性對照(1E7拷貝/μL)
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50μL
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0.5mL黃蓋管
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使用手冊
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1份
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無
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本產品采用五孔盒包裝
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注 意：引物-探針干粉在使用前需要離心，然后在離心管中加入165mL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。
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使用方法
稀釋標準曲線樣品以1E1-1E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供DNA片段作為陽性對照。
1. 標記6個離心管，分別為6，5，4，3，2，1。
2. 用帶芯槍頭分別加入45μL熒光PCR專用模板稀釋液，用帶芯槍頭（下同）。
3. 在6號管中加入5 μL 1E7拷貝/μL的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩混勻1分鐘，得到1E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1E6拷貝/μL的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩混勻1分鐘，得到1E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號管中加入5 μL 1E5拷貝/μL的陽性對照(上步所得)，充分震蕩混勻1分鐘，得到1E4拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 依次重復上面的操作得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
樣品DNA的制備
7. 如果有N個樣品，設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10 μL上步所得4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。
8. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數樣品DNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。
qPCR 反應20 μL體系，在樣品制備室進行
9. 如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做1次重復，則標記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（直接用第6步第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數據處理
1. 如果擴增陽性對照或制備陽性對照結果為陰性，則整個擴增或制備實驗無效，不需要分析數據，需要重做擴增或制備或跟廠家聯系。如果擴增陰性對照或制備陰性對照結果為陽性，說明環境污染，則整個擴增或制備實驗無效，不需要分析數據，需要跟廠家聯系，購買新的引物和探針。
2. 如果陰性對照和陽性對照正常，則實驗有效，可以進入后續分析。
3. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
4. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照必須無Ct或Ct大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于40，否則實驗無效。如果實驗有效，則分析待測樣品，如果無Ct或Ct大于或等于40，則為陰性。如果Ct小于40則為陽性。
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