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GMO外源nptII基因探針?lè)╭PCR試劑盒
產(chǎn)品及特點(diǎn)
用PCR篩查轉(zhuǎn)基因植物的時(shí)候，通常選擇外源啟動(dòng)子、外源功能基因或外源終止子等GMO元件作為靶分子。如果待測(cè)樣本中有上述靶分子存在，就可以初步斷定該樣本中有轉(zhuǎn)基因成分。來(lái)于細(xì)菌轉(zhuǎn)座子Tn5的nptII（Neomycin Phosphotransferase 2，新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶2）基因就是常用的GMO外源功能基因，該基因并不存在于天然的植物細(xì)胞中。由于它能賦予轉(zhuǎn)基因細(xì)胞卡那霉抗性，在開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)基因植物過(guò)程中用于細(xì)胞篩選，常存于得到的轉(zhuǎn)基因植物中，故可以用作轉(zhuǎn)基因篩查的靶分子。本產(chǎn)品就是以探針?lè)晒舛縋CR技術(shù)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的專門篩查GMO材料中外源npt II基因的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
用PCR篩查轉(zhuǎn)基因植物的時(shí)候，通常選擇外源啟動(dòng)子、外源功能基因或外源終止子等GMO元件作為靶分子。如果待測(cè)樣本中有上述靶分子存在，就可以初步斷定該樣本中有轉(zhuǎn)基因成分。來(lái)于細(xì)菌轉(zhuǎn)座子Tn5的nptII（Neomycin Phosphotransferase 2，新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶2）基因就是常用的GMO外源功能基因，該基因并不存在于天然的植物細(xì)胞中。由于它能賦予轉(zhuǎn)基因細(xì)胞卡那霉抗性，在開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)基因植物過(guò)程中用于細(xì)胞篩選，常存于得到的轉(zhuǎn)基因植物中，故可以用作轉(zhuǎn)基因篩查的靶分子。本產(chǎn)品就是以探針?lè)晒舛縋CR技術(shù)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的專門篩查GMO材料中外源npt II基因的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開(kāi)即用，用戶只需要提供DNA樣品。
2. 引物和探針經(jīng)過(guò)優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達(dá)到100拷貝/μL。
3. 特異性高，根據(jù)GMO外源nptII基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，不會(huì)跟其他基因發(fā)生交叉反應(yīng)。
4. 提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。
5. 所用探針為FAM標(biāo)記，可以跟其他熒光標(biāo)記的GMO PCR檢測(cè)組合成多重檢測(cè)。
6. 快速，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程（按一個(gè)樣品計(jì)）所需時(shí)間僅2小時(shí)。
7. 既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。用于定量檢測(cè)時(shí)線性范圍至少為5個(gè)數(shù)量級(jí)。
8. 本產(chǎn)品足夠50次20 μL體系的探針?lè)晒舛縋CR。
9. 本產(chǎn)品只可用于科研。
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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2×Probe qPCR MasterMix |
0.5mL |
0.5mL本色管 |
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熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL |
1.5mL綠蓋管 |
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GMO外源nptII基因探針?lè)╭PCR引物-探針混合干粉 |
50次 |
0.5mL棕色管 |
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GMO外源nptII基因探針?lè)╭PCR陽(yáng)性對(duì)照（1E7拷貝/μL) |
50μL |
0.5mL黃蓋管 |
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超純水 |
1mL |
1.5mL藍(lán)蓋管 |
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使用手冊(cè) |
1份 |
無(wú) |
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本產(chǎn)品采用五孔盒包裝 |
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注 意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入165uL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以陽(yáng)性對(duì)照1E1-1E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度和內(nèi)參固定在1E3拷貝/μL為例
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。
稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以陽(yáng)性對(duì)照1E1-1E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度和內(nèi)參固定在1E3拷貝/μL為例
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。
1. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為6，5，4，3，2，1。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
3. 在6號(hào)管中加入5 μL陽(yáng)性對(duì)照（濃度為1×10E7拷貝/μL，本試劑盒提供），充分震蕩1分鐘，得1E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1E6拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照（上步稀釋所得），充分震蕩1分鐘，得1E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號(hào)管中加入5 μL 1E5拷貝/mL的陽(yáng)性對(duì)照（上步稀釋所得），充分震蕩1分鐘，得 1E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
樣品DNA的制備
7. 如果有N個(gè)樣品，設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用10 μL上步所得4號(hào)稀釋液再加上一定量的水使總體積跟核酸純化試劑盒所要求的樣本起始體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果有N個(gè)樣品，則需要進(jìn)行N+2個(gè)樣品提取，多出的一個(gè)用作樣品制備陽(yáng)性對(duì)照管、另一個(gè)用作樣品制備陰性對(duì)照管。
8. 用自選方法純化樣品的DNA，本產(chǎn)品跟市場(chǎng)上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容，也可以選購(gòu)本公司的免提取核酸釋放劑。
Probe qPCR反應(yīng)20 μL體系，在樣品制備室進(jìn)行
9. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），1個(gè)用于PCR陽(yáng)性對(duì)照（用第一步稀釋得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列稀釋液的第3號(hào)做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數(shù)據(jù)處理
1. 如果樣本制備陽(yáng)性對(duì)照或PCR陽(yáng)性對(duì)照(包括標(biāo)曲樣本)結(jié)果為陰性，則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無(wú)效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重新樣本制備，重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增或跟廠家聯(lián)系。如果樣本制備陰性對(duì)照或PCR陰性對(duì)照結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明環(huán)境污染，則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無(wú)效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系。
2. 如果陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照均正常，則實(shí)驗(yàn)有效，可以進(jìn)入后續(xù)分析。
3. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以FAM通道的Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的FAM通道的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
4. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照FAM通道的Ct必須沒(méi)有讀數(shù)，或者大于或等于40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，F(xiàn)AM通道的Ct值應(yīng)該小于40。對(duì)待測(cè)樣品，如果其FAM通道的Ct沒(méi)有讀數(shù)、大于或等于40則均為陰性，如果小于40則為陽(yáng)性。
自備試劑
樣品DNA
樣品DNA
運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期2年
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期2年
