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產品及特點
立克次體 (Rickettsias) 是一大類專性真核細胞內寄生的原核微生物，常呈多形性，革蘭氏陰性。多種立克次體是重要的人獸共患病原體，可通過媒介昆蟲的叮咬和排泄物、或氣溶膠進行傳播，廣泛分布于世界各地。常見的立克次體疾病主要有斑疹傷寒、斑點熱、恙蟲病、Q熱，其對應的病原體分別為斑疹傷寒群立克次體 (Typhus Group Rickettsiae，TGＲ)、斑點熱群立克次體(Spotted Fever Group Rickettsiae，SFGR) 、恙蟲病東方體（Orientia tsutsugamushi，Ot) 和貝氏柯克斯體(Coxiella burnetii，Cb) 。本產品就是以探針法熒光定量PCR技術為基礎開發(fā)的專門檢測上述四種之一的斑點熱群立克次體通用的試劑盒，它具有下列特點：
立克次體 (Rickettsias) 是一大類專性真核細胞內寄生的原核微生物，常呈多形性，革蘭氏陰性。多種立克次體是重要的人獸共患病原體，可通過媒介昆蟲的叮咬和排泄物、或氣溶膠進行傳播，廣泛分布于世界各地。常見的立克次體疾病主要有斑疹傷寒、斑點熱、恙蟲病、Q熱，其對應的病原體分別為斑疹傷寒群立克次體 (Typhus Group Rickettsiae，TGＲ)、斑點熱群立克次體(Spotted Fever Group Rickettsiae，SFGR) 、恙蟲病東方體（Orientia tsutsugamushi，Ot) 和貝氏柯克斯體(Coxiella burnetii，Cb) 。本產品就是以探針法熒光定量PCR技術為基礎開發(fā)的專門檢測上述四種之一的斑點熱群立克次體通用的試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。
2. 引物和探針經過優(yōu)化，分析靈敏度高，可以達到100拷貝/反應。
3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據斑點熱群立克次氏體DNA高度保守區(qū)設計，不會跟其他生物的DNA發(fā)生交叉反應。
5. in silico分析發(fā)現(xiàn)本產品可以檢測R.rickettsii、R.heilongjiangensis、R.sibirica、R.raoultii、R.conori和R.montana這些屬于SFGR的立克次氏體。
6. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5個數量級。
7. 本產品足夠50次20 μL體系的探針法熒光定量PCR反應。
8. 本產品只能用于科研。
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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2×Probe qPCR MasterMix |
0.5mL |
0.5mL本色管 |
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熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL |
1.5mL綠蓋管 |
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超純水 |
1mL |
1.5mL藍蓋管 |
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斑點熱群立克次氏體qPCR引物-探針干粉 |
50次 |
0.5mL棕色管 |
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斑點熱群立克次氏體qPCR陽性對照(1E7拷貝/μL) |
50μL |
0.5mL黃蓋管 |
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使用手冊 |
1份 |
1份 |
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本產品采用五孔盒包裝 |
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注 意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入165 mL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。
1. 標記6個離心管，分別為6、5、4、3、2、1。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
3. 在6號管中加入5 μL 1E7拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號管中加入5 μL 1E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E4拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
樣品DNA的制備
7. 如果有N個樣品，設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0 μL上步所得4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟核酸制備試劑盒所要求的起始樣本體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。
8. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數樣品DNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。
Probe qPCR反應20 μL體系，在樣品制備室進行
9. 如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做1次重復，則標記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（直接用第6步第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數據處理
1. 如果樣本制備陽性對照或PCR陽性對照(包括標曲樣本)結果為陰性，則整個實驗無效，不需要分析數據，需要重新樣本制備，重新進行PCR擴增或跟廠家聯(lián)系。如果樣本制備陰性對照或PCR陰性對照結果為陽性，說明環(huán)境污染，則整個實驗無效，不需要分析數據，需要跟廠家聯(lián)系。
2. 如果陰性對照和陽性對照均正常，則實驗有效，可以進入后續(xù)分析。
3. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照必須無Ct或Ct大于或等于40。15. 陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于40，否則實驗無效。如果實驗有效，則分析待測樣品，如果無Ct或Ct大于或等于40，則為陰性。如果Ct小于40則為陽性。
自備試劑
樣品DNA
樣品DNA
運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存，有效期2年
低溫運輸，-20℃保存，有效期2年
