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油菜內源PEP基因探針法qPCR試劑盒
產品及特點
內參基因是轉基因檢測標識制度中所必需的檢測參照基因。在用PCR對待檢測樣品基因組DNA的轉入基因進行檢測時，還需要對內參基因同時進行擴增，以排除假陰性結果，保證檢測結果的可靠。同時內參基因的拷貝數是固定不變的，因此通過靶基因和內參基因的PCR結果比較，可以對靶基因進行相對定量。因此GMO內參基因的檢測具有重要的意義。本產品是專用于檢測油菜（Rape，Brassica napus，Bna）內源PEP（Phosphoenolpyruvate carboxylase，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶）基因的探針法qPCR試劑盒，它具有下列特點：
內參基因是轉基因檢測標識制度中所必需的檢測參照基因。在用PCR對待檢測樣品基因組DNA的轉入基因進行檢測時，還需要對內參基因同時進行擴增，以排除假陰性結果，保證檢測結果的可靠。同時內參基因的拷貝數是固定不變的，因此通過靶基因和內參基因的PCR結果比較，可以對靶基因進行相對定量。因此GMO內參基因的檢測具有重要的意義。本產品是專用于檢測油菜（Rape，Brassica napus，Bna）內源PEP（Phosphoenolpyruvate carboxylase，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶）基因的探針法qPCR試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供DNA樣品。
2. 引物和探針經過優化，分析靈敏性高，可以達到100拷貝/μL。
3. 特異性高，根據油菜內源PEP基因保守區域設計引物和探針，能專一性地檢測出樣品中的油菜內源PEP基因，不會跟其他基因發生交叉反應，因此不能檢測其他非油菜內源PEP基因成分。
4. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。
5. 所用探針為Cy5標記，可以跟其他熒光標記的GMO PCR檢測組合成多重檢測。
6. 快速，整個檢測過程（按一個樣品計）所需時間僅2小時。
7. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。定量檢測時線性范圍至少為5個數量級。
8. 本產品足夠50次20 μL體系的探針法熒光定量PCR。
9. 本產品只可用于科研。
規格及成分
規格及成分
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成分 |
規格 |
包裝 |
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2×Probe qPCR MasterMix |
0.5mL |
0.5mL本色管 |
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熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL |
1.5mL綠蓋管 |
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油菜內源PEP基因探針法qPCR引物-探針混合干粉 |
50次 |
0.5mL棕色管 |
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油菜內源PEP基因PCR陽性對照（1E7拷貝/μL) |
50μL |
0.5mL黃蓋管 |
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超純水 |
1mL |
1.5mL藍蓋管 |
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使用手冊 |
1份 |
無 |
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本產品采用五孔盒包裝 |
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注 意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入165uL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀釋標準曲線樣品以陽性對照1E1-1E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度和內參固定在1E3拷貝/μL為例
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。
稀釋標準曲線樣品以陽性對照1E1-1E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度和內參固定在1E3拷貝/μL為例
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。
1. 標記6個離心管，分別為6，5，4，3，2，1。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
3. 在6號管中加入5 μL陽性對照（濃度為1×10E7拷貝/μL，本試劑盒提供），充分震蕩1分鐘，得1E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1E6拷貝/μL的陽性對照（上步稀釋所得），充分震蕩1分鐘，得1E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號管中加入5 μL 1E5拷貝/μL的陽性對照（上步稀釋所得），充分震蕩1分鐘，得 1E4拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
樣品DNA的制備
7. 如果有N個樣品，設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10 μL上步所得4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟核酸純化試劑盒所要求的樣本起始體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果有N個樣品，則需要進行N+2個樣品提取，多出的一個用作樣品制備陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。
8. 用自選方法純化樣品的DNA，本產品跟市場上絕大多數核酸純化產品兼容，也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。
Probe qPCR反應20 μL體系，在樣品制備室進行
9. 如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復，則標記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（用第一步稀釋得到的標準曲線系列稀釋液的第3號做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數據處理
1. 如果樣本制備陽性對照或PCR陽性對照(包括標曲樣本)結果為陰性，則整個實驗無效，不需要分析數據，需要重新樣本制備，重新進行PCR擴增或跟廠家聯系。如果樣本制備陰性對照或PCR陰性對照結果為陽性，說明環境污染，則整個實驗無效，不需要分析數據，需要跟廠家聯系。
2. 如果陰性對照和陽性對照均正常，則實驗有效，可以進入后續分析。
3. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Cy5通道的Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Cy5通道的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
4. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Cy5通道的Ct必須沒有讀數，或者大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Cy5通道的Ct值應該小于40。對待測樣品，如果其Cy5通道的Ct沒有讀數、大于或等于40則均為陰性，如果小于40則為陽性。
自備試劑
樣品DNA
樣品DNA
運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存，有效期2年
低溫運輸，-20℃保存，有效期2年
