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GMO外源hpt基因探針法qPCR試劑盒
產品及特點
用PCR篩查轉基因植物的時候，通常選擇外源啟動子、外源功能基因或外源終止子等GMO元件作為靶分子。如果待測樣本中有上述靶分子存在，就可以初步斷定該樣本中有轉基因成分。來于大腸桿菌或鏈球菌（Streptomyces hygroscopicus）的hpt（hygromycin phosphotransferase，潮霉素磷酸轉移酶）基因，就是常用的GMO外源功能基因，該基因并不存在于天然的植物細胞中。其編碼的潮霉素磷酸轉移酶，能使潮霉素磷酸化而失活，與抗潮霉素的性狀相關。本產品就是以探針法熒光定量PCR技術為基礎開發(fā)的專門篩查GMO材料中外源hpt基因的試劑盒，它具有下列特點：
用PCR篩查轉基因植物的時候，通常選擇外源啟動子、外源功能基因或外源終止子等GMO元件作為靶分子。如果待測樣本中有上述靶分子存在，就可以初步斷定該樣本中有轉基因成分。來于大腸桿菌或鏈球菌（Streptomyces hygroscopicus）的hpt（hygromycin phosphotransferase，潮霉素磷酸轉移酶）基因，就是常用的GMO外源功能基因，該基因并不存在于天然的植物細胞中。其編碼的潮霉素磷酸轉移酶，能使潮霉素磷酸化而失活，與抗潮霉素的性狀相關。本產品就是以探針法熒光定量PCR技術為基礎開發(fā)的專門篩查GMO材料中外源hpt基因的試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供DNA樣品。
2. 引物和探針經過優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達到100拷貝/μL。
3. 特異性高，根據GMO外源hpt基因保守區(qū)域設計引物和探針，不會跟其他基因發(fā)生交叉反應。
4. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
5. 所用探針為FAM標記，可以跟其他熒光標記的GMO PCR檢測組合成多重檢測。
6. 快速，整個檢測過程（按一個樣品計）所需時間僅2小時。
7. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5個數(shù)量級。
8. 本產品足夠50次20 μL體系的探針法熒光定量PCR。
9. 本產品只可用于科研。
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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2×Probe qPCR MasterMix |
0.5mL |
0.5mL本色管 |
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熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL |
1.5mL綠蓋管 |
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GMO外源hpt基因探針法qPCR引物-探針混合干粉 |
50次 |
0.5mL棕色管 |
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GMO外源hpt基因探針法qPCR陽性對照（1E7拷貝/μL） |
50μL |
0.5mL黃蓋管 |
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超純水 |
1mL |
1.5mL藍蓋管 |
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使用手冊 |
1份 |
無 |
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本產品采用五孔盒包裝 |
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注 意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入165uL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀釋標準曲線樣品以陽性對照1E1-1E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度和內參固定在1E3拷貝/μL為例
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。
稀釋標準曲線樣品以陽性對照1E1-1E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度和內參固定在1E3拷貝/μL為例
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。
1. 標記6個離心管，分別為6，5，4，3，2，1。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
3. 在6號管中加入5 μL陽性對照（濃度為1×1E7拷貝/μL，本試劑盒提供），充分震蕩1分鐘，得1E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1E6拷貝/mL的陽性對照（上步稀釋所得），充分震蕩1分鐘，得1E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號管中加入5 μL 1E5拷貝/μL的陽性對照（上步稀釋所得），充分震蕩1分鐘，得 1E4拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
樣品DNA的制備
7. 如果有N個樣品，設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10 μL上步所得4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟核酸純化試劑盒所要求的樣本起始體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果有N個樣品，則需要進行N+2個樣品提取，多出的一個用作樣品制備陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。
8. 用自選方法純化樣品的DNA，本產品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產品兼容，也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。
Probe qPCR反應20 μL 體系，在樣品制備室進行
9. 如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復，則標記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（用第一步稀釋得到的標準曲線系列稀釋液的第3號做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數(shù)據處理
1. 如果樣本制備陽性對照或PCR陽性對照(包括標曲樣本)結果為陰性，則整個實驗無效，不需要分析數(shù)據，需要重新樣本制備，重新進行PCR擴增或跟廠家聯(lián)系。如果樣本制備陰性對照或PCR陰性對照結果為陽性，說明環(huán)境污染，則整個實驗無效，不需要分析數(shù)據，需要跟廠家聯(lián)系。
2. 如果陰性對照和陽性對照均正常，則實驗有效，可以進入后續(xù)分析。
3. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以FAM通道的Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的FAM通道的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
4. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照FAM通道的Ct必須沒有讀數(shù)，或者大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，F(xiàn)AM通道的Ct值應該小于40。對待測樣品，如果其FAM通道的Ct沒有讀數(shù)、大于或等于40則均為陰性，如果小于40則為陽性。
自備試劑
樣品DNA
樣品DNA
運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存，有效期2年
低溫運輸，-20℃保存，有效期2年
