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辣椒輕斑駁病毒探針法qRT-PCR試劑盒
產品及特點
辣椒輕斑駁病毒（Pepper Mild Mottle Virus，PMMoV）屬于煙草花葉病毒屬的無包膜正義單鏈RNA病毒，基因組長度約6356 nt。該病毒可以通過種傳和汁液摩擦傳播，在干燥的植物病殘體上可存活長達25年。辣椒輕斑駁病毒會對辣椒生產造成嚴重影響，導致植株生長緩慢、葉片出現褪綠斑駁和花葉癥狀、果實變小且表面出現凹凸斑點等。因此快速檢測辣椒輕斑駁病毒具有重要的意義。為此，本公司以探針法qRT-PCR技術為基礎開發了辣椒輕斑駁病毒的檢測試劑，它具有下列特點：
產品及特點
辣椒輕斑駁病毒（Pepper Mild Mottle Virus，PMMoV）屬于煙草花葉病毒屬的無包膜正義單鏈RNA病毒，基因組長度約6356 nt。該病毒可以通過種傳和汁液摩擦傳播，在干燥的植物病殘體上可存活長達25年。辣椒輕斑駁病毒會對辣椒生產造成嚴重影響，導致植株生長緩慢、葉片出現褪綠斑駁和花葉癥狀、果實變小且表面出現凹凸斑點等。因此快速檢測辣椒輕斑駁病毒具有重要的意義。為此，本公司以探針法qRT-PCR技術為基礎開發了辣椒輕斑駁病毒的檢測試劑，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品RNA模板。
2. 引物和探針經過優化，分析靈敏度高，可以達到100拷貝/反應。
3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據辣椒輕斑駁病毒RNA高度保守區設計，不會跟其他生物的RNA發生交叉反應。
5. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。定量檢測時線性范圍至少5個數量級。
6. 本產品足夠50次20 μL體系的探針法qRT-PCR反應。
7. 本產品只能用于科研。
規格及成分
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成分 |
規格 |
包裝 |
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探針法qRT-PCR緩沖液 |
500μL |
0.5mL藍蓋管 |
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熒探針法qRT-PCR酶混合液v2 |
50μL |
0.5mL紅蓋管 |
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熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL |
1.5mL綠蓋管 |
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辣椒輕斑駁病毒qRT-PCR引物-探針干粉 |
50次 |
0.5mL棕色管 |
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辣椒輕斑駁病毒qRT-PCR陽性對照(1E7拷貝/μL) |
50μL |
0.5mL黃蓋管 |
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使用手冊 |
1份 |
無 |
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本產品采用五孔盒包裝 |
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注 意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入165μL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀釋標準曲線樣品以1E1-1E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。如果需要RNA陽性樣品，需要另外訂購。
稀釋標準曲線樣品以1E1-1E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。如果需要RNA陽性樣品，需要另外訂購。
1. 標記6個離心管，分別為6、5、4、3、2、1。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同。
3. 在6號管中加入5 μL 1E7拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號管中加入5 μL 1E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E4拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
樣品RNA的制備
7. 如果有N個樣品，設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10 μL上步所得第4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次樣本制備所要求的起始樣本體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。
8. 用自選方法純化樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數RNA提取試劑盒兼容，也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。
Probe qRT-PCR反應20μL體系，在樣品制備室進行
9. 如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個RT-PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做1次重復，則標記N+4個RT-PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），1個用于RT-PCR陽性對照（直接用第6步第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數據處理
1. 如果樣本制備陽性對照或RT-PCR陽性對照(包括標曲樣本)結果為陰性，則整個實驗無效，不需要分析數據，需要重新樣本制備，重新進行RT-PCR擴增或跟廠家聯系。如果樣本制備陰性對照或RT-PCR陰性對照結果為陽性，說明環境污染，則整個實驗無效，不需要分析數據，需要跟廠家聯系。
2. 如果陰性對照和陽性對照均正常，則實驗有效，可以進入后續分析。
3. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。
4. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須沒有讀數，或者大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于40。對待測樣品，如果其Ct沒有讀數、大于或等于40則均為陰性，如果小于40則為陽性。
自備試劑
樣品RNA，超純水，核酸純化試劑盒
樣品RNA，超純水，核酸純化試劑盒
運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存，有效期1年
低溫運輸，-20℃保存，有效期1年
