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產品及特點
泰國利什曼原蟲(Leishmania siamensis)屬于錐蟲科利什曼原蟲屬的一個蟲種。利什曼原蟲是一種通過蟲媒（沙蠅，或稱白蛉）傳播的單細胞寄生蟲，它可以寄生在人或狗的免疫細胞里并且不會被免疫細胞輕易殺死，然后通過免疫細胞游走全身，造成包括皮膚潰爛與器官衰竭等多種多樣的癥狀。利什曼原蟲病分成內臟型、皮膚型與較為罕見的粘膜型。泰國利什曼原蟲為內臟利什曼氏病的重要病原體。內臟利什曼病又稱黑熱病，是以白蛉為傳播媒介的一種慢性地方性傳染病，四季均有發病，春季逐漸增多，夏季明顯增多。內臟利什曼病是一種兒科綜合征，常累及嬰兒，小于3月齡的嬰兒發病率，死亡率也較高，對嬰幼兒的生命健康造成較大威脅。因此快速檢測泰國利什曼原蟲具有重要的意義。為此，本公司以探針法qPCR技術為基礎開發了泰國利什曼原蟲的檢測試劑盒，它具有下列特點：
泰國利什曼原蟲(Leishmania siamensis)屬于錐蟲科利什曼原蟲屬的一個蟲種。利什曼原蟲是一種通過蟲媒（沙蠅，或稱白蛉）傳播的單細胞寄生蟲，它可以寄生在人或狗的免疫細胞里并且不會被免疫細胞輕易殺死，然后通過免疫細胞游走全身，造成包括皮膚潰爛與器官衰竭等多種多樣的癥狀。利什曼原蟲病分成內臟型、皮膚型與較為罕見的粘膜型。泰國利什曼原蟲為內臟利什曼氏病的重要病原體。內臟利什曼病又稱黑熱病，是以白蛉為傳播媒介的一種慢性地方性傳染病，四季均有發病，春季逐漸增多，夏季明顯增多。內臟利什曼病是一種兒科綜合征，常累及嬰兒，小于3月齡的嬰兒發病率，死亡率也較高，對嬰幼兒的生命健康造成較大威脅。因此快速檢測泰國利什曼原蟲具有重要的意義。為此，本公司以探針法qPCR技術為基礎開發了泰國利什曼原蟲的檢測試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。
2. 引物和探針經過優化，分析靈敏度高，可以達到100拷貝/反應。
3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據泰國利什曼原蟲DNA高度保守區設計，不會跟其他生物的DNA發生交叉反應。
5. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。定量檢測時線性范圍至少為5個數量級。
6. 本產品足夠50次20 μL體系的探針法qPCR反應。
7. 本產品只能用于科研。
規格及成分
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成分 |
規格 |
包裝 |
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2×Probe qPCR MasterMix |
0.5mL |
0.5mL本色管 |
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熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL |
1.5mL綠蓋管 |
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超純水 |
1mL |
1.5mL藍蓋管 |
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泰國利什曼原蟲qPCR引物-探針干粉 |
50次 |
0.5mL棕色管 |
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泰國利什曼原蟲qPCR陽性對照(1E7拷貝/μL) |
50μL |
0.5mL黃蓋管 |
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使用手冊 |
1份 |
無 |
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本產品采用五孔盒包裝 |
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注 意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入165 μL的超純水充分混勻后得到引物-探針混合液再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀釋標準曲線樣品以1E1-1E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。
1. 標記6個離心管，分別為6、5、4、3、2、1。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
3. 在6號管中加入5 μL 1E7拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號管中加入5 μL 1E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E4拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
樣品DNA的制備
7. 如果有N個樣品，設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10 μL上步所得第4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次樣本制備所要求的起始樣本體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。
8. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數DNA提取試劑盒兼容，也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。
Probe qPCR反應20 μL體系，在樣品制備室進行
9. 如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做1次重復，則標記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（直接用第6步第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數據處理
1. 如果樣本制備陽性對照或PCR陽性對照(包括標曲樣本)結果為陰性，則整個實驗無效，不需要分析數據，需要重新樣本制備，重新進行PCR擴增或跟廠家聯系。如果樣本制備陰性對照或PCR陰性對照結果為陽性，說明環境污染，則整個實驗無效，不需要分析數據，需要跟廠家聯系。
2. 如果陰性對照和陽性對照均正常，則實驗有效，可以進入后續分析。
3. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
4. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須沒有讀數，或者大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于40。對待測樣品，如果其Ct沒有讀數、大于或等于40則均為陰性，如果小于40則為陽性。
自備試劑
樣品DNA，超純水，核酸純化試劑盒
樣品DNA，超純水，核酸純化試劑盒
運輸及保存
溫運輸，-20℃保存，有效期1年
溫運輸，-20℃保存，有效期1年
