產品及特點

耐萬古霉素腸球菌（Vancomycin-Resistant Enterococcus，VRE）又名萬古霉素抗藥性腸球菌，是腸球菌屬下的一種細菌，有著對萬古霉素這種抗生素的抗藥性。腸球菌是一種移生在腸道的革蘭氏陽性球菌，故名腸球菌。在十九世紀末發現，早期歸為鏈球菌屬。在腸球菌屬中，對人類有著病原性的有糞腸球菌（Enterococcus faecalis）及屎腸球菌（Enterococcus faecium）。而所有屎腸球菌更是有著抗藥性的，亦即所有屎腸球菌都是VRE。腸球菌屬的細菌主要是在腸內，亦可以在人類的消化道及尿道內發現。VRE特別對免疫系統受損的人有危險性，但是它令健康的人受感染則較少見。一般來說可以引起心內膜炎、敗血病及尿道感染等病癥。雖然相信有很大比例的雞只帶有VRE，但常見出現接觸的地方仍是在醫院（院內感染）。因此快速檢測耐萬古霉素腸球菌vanB具有重要的意義。本產品就是以探針法qPCR技術為基礎開發的專門檢測耐萬古霉素腸球菌vanB的試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。

2. 引物和探針經過優化，分析靈敏性高，可以達到100拷貝/反應。

3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據耐萬古霉素腸球菌vanB DNA高度保守區設計，不會跟其他生物的DNA發生交叉反應。

5. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5個數量級。

6. 本產品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應。

7. 本產品只能用于科研。

規格及成分

成分	規格	包裝
2×Probe qPCR MasterMix	0.5mL	0.5mL本色蓋
熒光PCR專用模板稀釋液	1mL	1.5mL綠蓋管
超純水	1mL	1.5mL藍蓋管
耐萬古霉素腸球菌vanB qPCR引物-探針干粉	50次	1.5mL棕色管
耐萬古霉素腸球菌vanB qPCR陽性對照(1×10E7拷貝/μL)	50μL	0.5mL黃蓋管
使用手冊	1份	無
本產品采用五孔盒包裝
注意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入162uL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。

使用方法

稀釋標準曲線樣品以10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例

由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。

1. 標記6個離心管，分別為6，5，4，3，2，1。

2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

3. 在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在4號管中加入5 μL 1×10E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

樣品DNA的制備

7. 如果有N個樣品，設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10μL上步所得4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟核酸制備試劑盒所要求的起始樣本體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。

8. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數樣品DNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。

Probe qPCR反應20μL體系，在樣品制備室進行

9. 如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做1次重復，則標記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（直接用第6步第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

數據處理

1. 如果樣本制備陽性對照或PCR陽性對照(包括標曲樣本)結果為陰性，則整個實驗無效，不需要分析數據，需要重新樣本制備，重新進行PCR擴增或跟廠家聯系。如果樣本制備陰性對照或PCR陰性對照結果為陽性，說明環境污染，則整個實驗無效，不需要分析數據，需要跟廠家聯系。

2. 如果陰性對照和陽性對照均正常，則實驗有效，可以進入后續分析。

3. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。

4. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照必須無Ct或Ct大于或等于35。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于35，否則實驗無效。如果實驗有效，則分析待測樣品，如果無Ct或Ct大于或等于35，則為陰性。如果Ct小于35則為陽性。

自備試劑
樣品DNA

運輸及保存

低溫運輸，-20℃保存，有效期2年

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