產品及特點

呼腸孤病毒3型（Reovirus type Ⅲ，Reo3）為呼腸孤病毒科的正呼腸孤病毒屬的代表株，是RNA病毒。呼腸孤病毒可以感染多種脊椎動物，包括馬、牛、豬、綿羊、豚鼠、犬、貓、貂、禽類、蝙蝠以及人、黑猩猩和猴，除了感染嚙齒動物和禽外，一般不引起明顯的疾病，特別是對成年動物。鼠類能自然感染Reo3，其臨床表現為黃疸、運動失調、油性被毛、生長發育遲緩等。呼腸孤病毒在人類的某些呼吸道及消化道疾病的發生上，呈現一定的輔助或促進作用，能引起兒童腹瀉、呼吸道感染及腦膜炎等疾病。因此檢測Reo3有重要的意義。本產品就是以探針法qRT-PCR技術為基礎開發的專門檢測呼腸孤病毒Ⅲ型RNA的試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品RNA模板。

2. 引物和探針經過優化，分析靈敏性高，可以達到100拷貝/反應。

3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據呼腸孤病毒Ⅲ型RNA高度保守區設計，不會跟其他生物的RNA發生交叉反應。

5. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5各數量級。

6. 本產品足夠50次20μL體系的探針法qRT-PCR反應。

7. 本產品只能用于科研。

規格及成分

成分	規格	包裝
探針法qRT-PCR緩沖液	500μL	0.5mL藍蓋管
探針法qRT-PCR酶混合液v2	50μL	0.5mL紅蓋管
熒光PCR專用模板稀釋液	1mL	1.5mL綠蓋管
呼腸孤病毒Ⅲ型qRT-PCR引物-探針干粉	50次	1.5mL棕色管
呼腸孤病毒Ⅲ型qRT-PCR陽性對照(1E7拷貝/μL)	50μL	0.5mL黃蓋管
使用手冊	1份	無
本產品采用五孔盒包裝
注意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入165μL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。

使用方法

稀釋標準曲線樣品以10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例

由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。如果需要RNA陽性樣品，需要另外訂購。

1. 標記6個離心管，分別為6，5，4，3，2，1。

2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

3. 在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在4號管中加入5 μL 1×10E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

樣品RNA的制備

7. 如果有N個樣品，設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10μL上步所得4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次樣本制備所要求的起始樣本體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。

8. 用自選方法純化樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數RNA提取試劑盒兼容，也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。

Probe qRT-PCR反應20μL體系，在樣品制備室進行

9. 如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個RT-PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做1次重復，則標記N+4個RT-PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），1個用于RT-PCR陽性對照（直接用第6步第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

數據處理

1. 如果擴增陽性對照或制備陽性對照結果為陰性，則整個擴增或制備實驗無效，不需要分析數據，需要重做擴增或制備或跟廠家聯系。如果擴增陰性對照或制備陰性對照結果為陽性，說明環境污染，則整個擴增或制備實驗無效，不需要分析數據，需要跟廠家聯系，購買新的引物和探針。

2. 如果陰性對照和陽性對照正常，則實驗有效，可以進入后續分析。

3. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。

4. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須沒有讀數，或者大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于40。對待測樣品，如果其Ct沒有讀數、大于或等于40則均為陰性，如果小于40則為陽性。

自備試劑
樣品RNA

運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存，有效期1年

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