簡介

FLAG標簽，或FLAG八肽，或FLAG表位，是一種多肽蛋白質(zhì)標簽，可以用重組DNA技術添加到蛋白質(zhì)中，其序列圖案為DYKDDDDK（其中D=天冬氨酸，Y=酪氨酸，K=賴氨酸），它是最特異的標簽之一，是一種通用種屬工抗原，已經(jīng)開發(fā)出特異的、高親和力的單克隆抗體，因此可用于親和層析法的蛋白質(zhì)純化，也可用于定位活細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，它已被用于分離重組的、過量表達的蛋白和宿主生物體表達的野生型蛋白，它還可用于分離具有多個亞單位的蛋白質(zhì)復合物，因為其溫和的純化過程往往不會破壞這種復合物，它已被用于獲得足夠純度和質(zhì)量的蛋白質(zhì)，以通過X射線晶體學進行三維結構測定，F(xiàn)LAG標簽可用于許多需要抗體識別的不同檢測中，如果沒有針對某一特定蛋白的抗體，在蛋白上添加FLAG標記，就可以用針對FLAG序列的抗體來研究該蛋白，例如通過免疫熒光、免疫沉淀或通過SDS PAGE蛋白電泳和Western印跡檢測進行細胞定位研究，從N端到C端的FLAG標簽的肽序列是，DYKDDDDK（1012Da），此外，它還可以串聯(lián)使用，常見的是3xFLAG肽，DYKDHD-G-DYKDHD-I-DYKDDDDK（最后一個標簽編碼一個腸激酶裂解位點），它可以與蛋白質(zhì)的C端或N端融合，或插入到蛋白質(zhì)內(nèi)，一些市售的抗體（如 M1/4E11）只有在N端出現(xiàn)時才能識別該表位，然而，其他可用的抗體（如M2）則對位置不敏感，F(xiàn)LAG標簽中的酪氨酸殘基可以被硫酸化，這可能會影響抗體對FLAG表位的識別，F(xiàn)LAG標簽可以與其他親和力標簽一起使用，例如多組氨酸標簽（His標簽）、HA標簽或myc標簽。

檢測原理

本試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術:將捕獲抗體包被于酶標板上，捕獲樣品及標準品中的待測物Flag-tag，清洗后，再加入生物素標記的檢測抗體進行孵育后清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測抗體”免疫復合物，隨后加入鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶進行孵育，待孵育結束后清洗，接著加入TMB顯色后，若樣本中有待測物則顯藍色，加入終止液停止反應。檢測過程中游離的成分均被洗去，用酶標儀在450 nm處測OD值，顏色的深淺和樣品中的待測物的含量呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣本中Flag-tag的濃度。

需要的其他材料

1. 酶標儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳；

2. 移液器及槍頭；

3. 蒸餾水或去離子水；

4. 100-1000 mL刻度量筒；

5. 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機；

6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；

7. 用于稀釋標準品和樣品的試管。

樣品保存

樣品收集后若在 1 周內(nèi)進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內(nèi)檢測），或-80℃（6個月內(nèi)檢測），避免反復凍融，標本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

試劑準備工作

使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。

洗滌液/稀釋液配置
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）

標準品配置

試劑盒中取出標準品，準備7個試管，先從160ng/mL標準品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至8ng/mL（例：50μL的標準品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的8ng/mL濃度標準品），隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將8ng/mL標準品依次2倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的標準品，依次為: 8ng/mL、 4ng/mL、 2ng/mL、 1ng/mL、 0.5ng/mL、 0.25ng/mL、 0.125ng/mL，從最高濃度標準品溶液中吸取500μL標準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標準品(0ng/mL)。

小鼠(Flag-tag) ELISA試劑盒

抗體工作液配置

使用前10分鐘，將100×生物素化抗體于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×生物素化抗體稀釋成1×生物素化抗體工作液，根據(jù)所需用量當日配置當日使用。

酶結合物工作液配置

使用前10分鐘，將100×SA-HRP溶液于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×SA-HRP稀釋成1×SA-HRP工作液，根據(jù)所需用量配置。

備注：如待測樣本中Flag-tag濃度高于標準品最高值，請根據(jù)實際情況選擇適當?shù)南♂尡稊?shù)。

結果的計算

計算標準品和樣本復孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標準曲線(作圖時去掉空白組的值)。或者使用能夠生成四參數(shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計算機軟件來創(chuàng)建標準曲線。

若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數(shù)。

示例數(shù)據(jù)

以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗數(shù)據(jù)建立標準曲線。

標準品濃度(ng/mL)	8	4	2	1	0.5	0.25	0.125	0
OD值	2.553	1.616	1.08	0.653	0.385	0.269	0.189	0.061
校正OD值	2.492	1.555	1.019	0.592	0.324	0.208	0.128	0

下圖所示標準曲線僅供示例，結果計算應以同次試驗標準品所繪標準曲線為準計算樣本結果

重復性

板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于10%。

靈敏度

經(jīng)樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為0.06ng/mL。

特異性

該試劑盒測定可識別重組小鼠Flag-tag。

其他相關蛋白在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL，并測定交叉反應性。沒有觀察到明顯的交叉反應。

使用ELISA試劑盒之前，請您必須完整閱讀說明書，本產(chǎn)品僅供科研使用，不能于臨床診斷或治療。

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小鼠Flag標簽(Flag-tag)ELISA試劑盒說明書
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ELISA試劑盒

PCR試劑盒

生化試劑盒

農(nóng)殘檢測試劑盒

細胞庫

基礎培養(yǎng)基

完全培養(yǎng)基

原代細胞

細胞專用培養(yǎng)基

細胞系

菌株

生化試劑

病理染色液

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標準品

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