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021-54845833/15800441009
簡介
磷酸化AKT蛋白(p-AKT)是一種信號轉導蛋白，在各種類型的腫瘤中發揮著抑制細胞凋亡的核心作用，AKT是一組三個絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶的總稱，在多個細胞過程中發揮關鍵作用，如葡萄糖代謝、細胞凋亡、細胞增殖、轉錄和細胞遷移，三個不同的基因編碼蛋白激酶B異構體的基因被稱為AKT1、AKT2和AKT3，分別編碼RAC α、β和γ絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，pAKT與預后不良以及化療和放療抗性有關。
檢測原理
本試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術:將捕獲抗體包被于酶標板上，捕獲樣品及標準品中的待測物p-AKT，清洗后，再加入生物素標記的檢測抗體進行孵育后清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測抗體”免疫復合物，隨后加入鏈霉親和素偶聯的辣根過氧化物酶進行孵育，待孵育結束后清洗，接著加入TMB顯色后，若樣本中有待測物則顯藍色，加入終止液停止反應。檢測過程中游離的成分均被洗去，用酶標儀在450 nm處測OD值，顏色的深淺和樣品中的待測物的含量呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣本中p-AKT的濃度。
需要的其他材料
1. 酶標儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳；
2. 移液器及槍頭；
3. 蒸餾水或去離子水；
4. 100-1000 mL刻度量筒；
5. 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機；
6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；
7. 用于稀釋標準品和樣品的試管。
樣品保存
樣品收集后若在 1 周內進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內檢測），或-80℃（6個月內檢測），避免反復凍融，標本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
試劑準備工作
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配置
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標準品配置
試劑盒中取出標準品，準備7個試管，先從320μmol/L標準品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至16μmol/L（例：50μL的標準品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的16μmol/L濃度標準品），隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將16μmol/L標準品依次2倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的標準品，依次為: 16μmol/L、 8μmol/L、 4μmol/L、 2μmol/L、 1μmol/L、 0.5μmol/L、 0.25μmol/L，從最高濃度標準品溶液中吸取500μL標準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標準品(0μmol/L)。
抗體工作液配置
使用前10分鐘，將100×生物素化抗體于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×生物素化抗體稀釋成1×生物素化抗體工作液，根據所需用量當日配置當日使用。
酶結合物工作液配置
使用前10分鐘，將100×SA-HRP溶液于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×SA-HRP稀釋成1×SA-HRP工作液，根據所需用量配置。
備 注：如待測樣本中p-AKT濃度高于標準品最高值，請根據實際情況選擇適當的稀釋倍數。
結果的計算
計算標準品和樣本復孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出四參數邏輯函數的標準曲線(作圖時去掉空白組的值)。或者使用能夠生成四參數邏輯（4-P）曲線擬合的計算機軟件來創建標準曲線。
若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數。
示例數據
以下數據和曲線僅供參考，實驗者需根據自己的實驗數據建立標準曲線。
|
標準品濃度(μmol/L) |
16 |
8 |
4 |
2 |
1 |
0.5 |
0.25 |
0 |
|
OD值 |
2.484 |
1.781 |
1.016 |
0.755 |
0.425 |
0.261 |
0.154 |
0.061 |
|
校正OD值 |
2.423 |
1.72 |
0.955 |
0.694 |
0.364 |
0.2 |
0.093 |
0 |
下圖所示標準曲線僅供示例，結果計算應以同次試驗標準品所繪標準曲線為準計算樣本結果
重復性
板內變異系數小于10%，板間變異系數小于10%。
靈敏度
經樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為0.13μmol/L。
特異性
該試劑盒測定可識別重組小鼠p-AKT。
其他相關蛋白在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL，并測定交叉反應性。沒有觀察到明顯的交叉反應。
