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羊血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)ELISA試劑盒
簡(jiǎn)介
血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGF-A）是一種蛋白質(zhì)，由VEGF-AA基因編碼的。該基因是血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）家族的成員，編碼的蛋白質(zhì)通常以二硫連接的同源二聚體形式出現(xiàn)。該蛋白是一種糖基化的有絲分裂素，特異性地作用于內(nèi)皮細(xì)胞，具有多種作用，包括介導(dǎo)血管通透性增加，誘導(dǎo)血管生成、血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞遷移，抑制細(xì)胞凋亡。編碼自由分泌的或與細(xì)胞相關(guān)的異構(gòu)體的替代性剪接轉(zhuǎn)錄變體已被確定為特征，VEGF-A對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞顯示出突出的活性，主要是通過它與內(nèi)皮細(xì)胞膜上突出的VEGFR1和-R2受體的相互作用。雖然，它對(duì)其他一些細(xì)胞類型也有影響（例如，刺激單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞遷移、神經(jīng)元、癌細(xì)胞、腎臟上皮細(xì)胞），在體外，VEGF-A已被證明可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂和細(xì)胞遷移，VEGF-A也是一種血管擴(kuò)張劑，增加微血管的通透性，最初被稱為血管通透性因子。
檢測(cè)原理
本試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術(shù) : 將捕獲抗體包被于酶標(biāo)板上，捕獲樣品及標(biāo)準(zhǔn)品中的待測(cè)物VEGFA，清洗后，再加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體進(jìn)行孵育后清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測(cè)抗體”免疫復(fù)合物，隨后加入鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶進(jìn)行孵育，待孵育結(jié)束后清洗，接著加入TMB顯色后，若樣本中有待測(cè)物則顯藍(lán)色，加入終止液停止反應(yīng)。檢測(cè)過程中游離的成分均被洗去，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)OD值，顏色的深淺和樣品中的待測(cè)物的含量呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中VEGFA的濃度。
需要的其他材料
1. 酶標(biāo)儀，包含450nm測(cè)定波長(zhǎng)，同時(shí)包含600-680nm校正波長(zhǎng)更佳；
2. 移液器及槍頭；
3. 蒸餾水或去離子水；
4. 100-1000 mL刻度量筒；
5. 洗瓶、排槍或自動(dòng)微孔板清洗機(jī)；
6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；
7. 用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的試管。
樣品保存
樣品收集后若在 1 周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的可保存于4℃，若不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），或-80℃（6個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），避免反復(fù)凍融，標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。
試劑準(zhǔn)備工作
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配置
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標(biāo)準(zhǔn)品配置
試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)備7個(gè)試管，先從20ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至1000pg/mL（例：50μL的標(biāo)準(zhǔn)品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的1000pg/mL濃度標(biāo)準(zhǔn)品），隨后在6個(gè)試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個(gè)單獨(dú)的試管中將1000pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品依次2倍倍比稀釋至6個(gè)梯度，共配制7個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，依次為: 1000pg/mL、 500pg/mL、 250pg/mL、
125pg/mL、 62.5pg/mL、 31.25pg/mL、 15.63pg/mL，從最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中吸取500μL標(biāo)準(zhǔn)品到下一個(gè)試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標(biāo)準(zhǔn)品(0pg/mL)。
抗體工作液配置
使用前10分鐘，將100×生物素化抗體于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×生物素化抗體稀釋成1×生物素化抗體工作液，根據(jù)所需用量當(dāng)日配置當(dāng)日使用。
酶結(jié)合物工作液配置
使用前10分鐘，將100×SA-HRP溶液于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×SA-HRP稀釋成1×SA-HRP工作液，根據(jù)所需用量配置。
備 注：如待測(cè)樣本中VEGFA濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況選擇適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。
結(jié)果的計(jì)算
計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(作圖時(shí)去掉空白組的值)。或者使用能夠生成四參數(shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計(jì)算機(jī)軟件來創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)并在計(jì)算樣本濃度時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
示例數(shù)據(jù)
標(biāo)準(zhǔn)品濃度(pg/mL)
1000
500
250
125
62.5
31.25
15.63
0
OD值
2.436
1.769
0.977
0.707
0.443
0.262
0.131
0.066
2.370
1.703
0.911
0.641
0.377
0.196
0.065
0
以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
下圖所示標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供示例，結(jié)果計(jì)算應(yīng)以同次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線為準(zhǔn)計(jì)算樣本結(jié)果
重復(fù)性
板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于10%。
靈敏度
經(jīng)樣本測(cè)試，本試劑盒的檢測(cè)靈敏度為7.82pg/mL。
特異性
該試劑盒測(cè)定可識(shí)別重組羊VEGFA。
其他相關(guān)蛋白在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL，并測(cè)定交叉反應(yīng)性。沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)。
使用ELISA試劑盒之前，請(qǐng)您必須完整閱讀說明書，本產(chǎn)品僅供科研使用，不得用于臨床診斷和治療。
