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產(chǎn)品及特點(diǎn)：
犬冠狀病毒(Canine coronavirus，CCV )為單鏈 RNA 病毒，有 6～7 種多肽，其中 4 種是糖肽，不含 RNA 聚合酶及神經(jīng)氨酸酶。可使犬發(fā)生程度不同的胃腸炎癥狀，特征有頻繁嘔吐、腹瀉、沉郁、厭食等癥狀。本病一年四季均可發(fā)生，以冬季多發(fā)，病犬是主要的傳染原，犬可通過(guò)呼吸道、消化道、糞便及污染物傳染。該病一但發(fā)生，同窩犬同室犬很難控制均可造成感染。幼犬死亡率較高,對(duì)幼犬的危害較大。最近的研究發(fā)現(xiàn),CCV 感染的宿主范圍有不斷擴(kuò)大的趨勢(shì),許多野生動(dòng)物如虎、獅、大熊貓、小熊貓、水紹也可感染。所以對(duì)犬呼吸道病毒的快速準(zhǔn)確檢測(cè)與鑒定具有重要的臨床意義。本產(chǎn)品根據(jù) RT-PCR 原理開(kāi)發(fā)，
1. 一站式，用戶(hù)不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對(duì)照。
2. 根據(jù)犬冠狀病毒的保守基因序列設(shè)計(jì)的引物，具有良好的特異性。
3. 靈敏度可以達(dá)到 1000 拷貝/反應(yīng)。
4. 使用一管式 RT-PCR 技術(shù)，RT 和 PCR 兩步在一個(gè)試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的 RT-PCR。
6. 本產(chǎn)品只能用于科研，不能用于臨床。
規(guī)格及成分：
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編號(hào) |
成分 |
規(guī)格 |
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試劑一 |
5×雙酶一管式 RT-PCR Buffer |
200 μL（橘黃蓋） |
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試劑二 |
MMLV-Taq Mix |
75 μL（紅蓋） |
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試劑三 |
超純水 |
1 mL（亮黃蓋） |
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試劑四 |
犬冠狀病毒 RT-PCR 引物混合液 |
100 μL（白蓋） |
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試劑五 |
犬冠狀病毒 RT-PCR 陽(yáng)性對(duì)照（1×10E8 /μL） |
50 μL（黃蓋） |
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試劑六 |
使用手冊(cè) |
1 份 |
運(yùn)輸及保存：
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。收到貨后陽(yáng)性對(duì)照需要跟其他成分分開(kāi)放置，因?yàn)槠淙菀孜廴酒渌煞郑斐杉訇?yáng)性。
自備試劑：
樣品 RNA。
使用方法：
一、樣品 DNA 的制備：
1. 如果有 N 個(gè)樣品，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用 10μL犬冠狀病毒PCR陽(yáng)性對(duì)照的 1000 倍稀釋液作為制備的陽(yáng)性對(duì)照。可以用水作為制備的陰性對(duì)照。制備所得成為樣品 RNA。
2. 用自選方法純化 N+2 個(gè)樣品的 RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。可以選購(gòu)本公司的柱式病毒 RNAout。
二、設(shè)置RT- PCR 反應(yīng)(20μL 體系)：
3. 如果有 N+2 個(gè)樣品，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管(額外增加的兩個(gè)管一個(gè)是RT-PCR 陽(yáng)性對(duì)照，另一個(gè)是 RT-PCR 陰性對(duì)照)并按照下表在 PCR 管中加入下列成分：
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成份 |
N+2 個(gè) 樣品管 |
RT-PCR 陰性對(duì)照 |
RT-PCR 陽(yáng)性對(duì)照 |
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5×雙酶一管式RT-PCR Buffer |
各 4 μL |
4 μL |
4 μL |
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犬冠狀病毒 RT-PCR 引物混合液 |
各 2 μL |
2μL |
2μL |
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N+2 個(gè)制備的 RNA 樣品 |
各 12.5μL |
-- |
-- |
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超純水 |
-- |
12.5μL |
-- |
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犬冠狀病毒 RT-PCR 陽(yáng)性對(duì)照的 1000倍稀釋液 |
-- |
-- |
12.5μL |
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MMLV-Taq Mix |
1.5 μL |
1.5 μL |
1.5 μL |
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過(guò)程 |
溫度 |
時(shí)間 |
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逆轉(zhuǎn)錄 |
42℃ |
30 min |
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預(yù)變性 |
95℃ |
5 min |
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PCR 反應(yīng)35個(gè)循環(huán) |
95℃ |
30 sec |
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58℃ |
30 sec |
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72℃ |
20 sec |
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最后延伸 |
72℃ |
7 min |
5. 瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果。如果陰性對(duì)照有擴(kuò)增產(chǎn)物或陽(yáng)性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，則說(shuō)明實(shí)驗(yàn)失敗，需要分析實(shí)驗(yàn)失敗的原因。只有在陰性對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物、陽(yáng)性對(duì)照必須有預(yù)期條帶出現(xiàn)，才有必要分析樣品的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如果有預(yù)期片段大小的擴(kuò)增產(chǎn)物則為陽(yáng)性，如果無(wú)則為陰性。
四、特別提示：
本公司的所有產(chǎn)品，僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！
