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021-54845833/15800441009
人外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶2(ENPP2)ELISA試劑盒
簡介
外自分泌運動因子（ATX），也被稱為外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶2 (ENPP2或 NPP2)，是由ENPP2基因編碼的酶，是一種分泌酶，對于生成脂質信號分子溶血磷脂酸(LPA) 很重要，它具有溶血磷脂酶D活性，可將溶血磷脂酰 膽堿轉化為LPA，它最初被確定為一種腫瘤細胞運動刺激因子，后來它被證 明是LPA（通過溶血磷脂受體發出信號），這是由它催化的反應的脂質產物，它負責其對細胞增殖的影響，該基因編碼的蛋白質起磷酸二酯酶的作用，它被分泌并進一步加工以形成具有生物活性的形式，已經鑒定了幾種可變剪接 的轉錄變體，它能夠切割三磷酸核苷酸的α和β位之間的磷酸二酯鍵，作為產 生焦磷酸的外核苷酸磷酸二酯酶，與ENPP家族的大多數成員一樣，重要的是它還充當磷脂酶，催化去除各種溶脂的頭部基團，它的生理功能是在細胞外液中產生信號脂質溶血磷脂酸(LPA)，LPA 引起生長因子樣反應，包括刺 激細胞增殖和趨化性，該基因產物刺激腫瘤細胞的運動，具有血管生成特性， 并且其表達在幾種腫瘤中上調，此外，它和 LPA 與許多炎癥驅動的疾病有關， 例如哮喘和關節炎，從生理學上講，LPA 有助于促進對組織損傷的傷口愈合反應，在正常情況下，LPA 負調控它轉錄，但在傷口修復的情況下，細胞因子誘導它表達以增加整體LPA 濃度。
檢測原理
本試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術 :將捕獲抗體包被于酶標板上，捕獲樣品及標準品中的待測物ENPP2，清洗后，再加入生物素標記的檢測抗體進行孵育后清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測抗體”免疫復合物，隨后加入鏈霉親和素偶聯的辣根過氧化物酶進行孵育，待孵育結束后清洗，接著加入TMB顯色后，若樣本中有待測物則顯藍色，加入終止液停止反應。檢測過程中游離的成分均被洗去，用酶標儀在450 nm處測OD值，顏色的深淺和樣品中的待測物的含量呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣本中ENPP2的濃度。
需要的其他材料
1. 酶標儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳；
2. 移液器及槍頭；
3. 蒸餾水或去離子水；
4. 100-1000 mL刻度量筒；
5. 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機；
6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；
7. 用于稀釋標準品和樣品的試管。
樣品保存
樣品收集后若在 1 周內進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內檢測），或-80℃（6個月內檢測），避免反復凍融，標本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
試劑準備工作
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配置
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標準品配置
試劑盒中取出標準品，準備7個試管，先從120ng/mL標準品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至6000pg/mL（例：50μL的標準品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的6000pg/mL濃度標準品），隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將6000pg/mL標準品依次2倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的標準品，依次為: 6000pg/mL、 3000pg/mL、 1500pg/mL、 750pg/mL、 375pg/mL、 187.5pg/mL、 93.75pg/mL，從最高濃度標準品溶液中吸取500μL標準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標準品(0pg/mL)。
抗體工作液配置
使用前10分鐘，將100×生物素化抗體于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×生物素化抗體稀釋成1×生物素化抗體工作液，根據所需用量當日配置當日使用。
酶結合物工作液配置
使用前10分鐘，將100×SA-HRP溶液于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×SA-HRP稀釋成1×SA-HRP工作液，根據所需用量配置。
備 注：如待測樣本中ENPP2濃度高于標準品最高值，請根據實際情況選擇適當的稀釋倍數。
結果的計算
計算標準品和樣本復孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出四參數邏輯函數的標準曲線(作圖時去掉空白組的值)。或者使用能夠生成四參數邏輯（4-P）曲線擬合的計算機軟件來創建標準曲線。若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數。
示例數據
標準品濃度(pg/mL)
6000
3000
1500
750
375
187.5
93.75
0
OD值
2.467
1.624
1.091
0.632
0.508
0.268
0.136
0.08
校正OD值
2.387
1.544
1.011
0.552
0.428
0.188
0.056
0
以下數據和曲線僅供參考，實驗者需根據自己的實驗數據建立標準曲線。
下圖所示標準曲線僅供示例，結果計算應以同次試驗標準品所繪標準曲線為準計算樣本結果
重復性
板內變異系數小于10%，板間變異系數小于10%。
靈敏度
經樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為46.88pg/mL。
特異性
該試劑盒測定可識別重組人ENPP2。
其他相關蛋白在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL，并測定交叉反應性。沒有觀察到明顯的交叉反應。
使用ELISA試劑盒之前，請您必須完整閱讀說明書，本產品僅供科研使用，不得用于臨床診斷和治療。
