簡介

密封蛋白，也被稱為OCLN，是由OCLN基因編碼的酶，它是一種氧化NADH的酶，它首先在上皮細(xì)胞中被鑒定為位于緊密連接處的65kDa完整質(zhì)膜蛋白，與Claudins和zonula occludens-1 (ZO-1) 一起，它被認(rèn)為是緊密連接的主要成分，它不僅存在于上皮/內(nèi)皮細(xì)胞中，而且還在沒有緊密連接但代謝非?；钴S的細(xì)胞中大量表達(dá)：周細(xì)胞、神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞淋巴細(xì)胞和心肌，它影響細(xì)胞代謝的關(guān)鍵方面，如葡萄糖攝取、ATP產(chǎn)生和基因表達(dá)，它在維持緊密連接的阻隔特性方面起著關(guān)鍵作用，因此，它的突變或缺失會增加上皮滲漏，這是預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移的重要屏障，它在細(xì)胞凋亡中也起重要作用，它的突變被認(rèn)為是帶狀鈣化伴單純回旋和多微晶（BLC-PMG）的原因，BLC-PMG是一種常染色體隱性遺傳性神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

檢測原理

本試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術(shù):將捕獲抗體包被于酶標(biāo)板上，捕獲樣品及標(biāo)準(zhǔn)品中的待測物OCLN，清洗后，再加入生物素標(biāo)記的檢測抗體進(jìn)行孵育后清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測抗體”免疫復(fù)合物，隨后加入鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶進(jìn)行孵育，待孵育結(jié)束后清洗，接著加入TMB顯色后，若樣本中有待測物則顯藍(lán)色，加入終止液停止反應(yīng)。檢測過程中游離的成分均被洗去，用酶標(biāo)儀在450 nm處測OD值，顏色的深淺和樣品中的待測物的含量呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣本中OCLN的濃度。

需要的其他材料

1. 酶標(biāo)儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳；

2. 移液器及槍頭；

3. 蒸餾水或去離子水；

4. 100-1000 mL刻度量筒；

5. 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機(jī)；

6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；

7. 用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的試管。

樣品保存
樣品收集后若在 1 周內(nèi)進(jìn)行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內(nèi)檢測），或-80℃（6個月內(nèi)檢測），避免反復(fù)凍融，標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測。

試劑準(zhǔn)備工作

使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。

洗滌液/稀釋液配置

如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）

標(biāo)準(zhǔn)品配置

試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)備7個試管，先從400ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至20ng/mL（例：50μL的標(biāo)準(zhǔn)品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的20ng/mL濃度標(biāo)準(zhǔn)品），隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將20ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品依次2倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，依次為: 20ng/mL、 10ng/mL、 5ng/mL、 2.5ng/mL、 1.25ng/mL、 0.625ng/mL、 0.313ng/mL，從最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中吸取500μL標(biāo)準(zhǔn)品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標(biāo)準(zhǔn)品(0ng/mL)。

抗體工作液配置
使用前10分鐘，將100×生物素化抗體于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×生物素化抗體稀釋成1×生物素化抗體工作液，根據(jù)所需用量當(dāng)日配置當(dāng)日使用。

酶結(jié)合物工作液配置
使用前10分鐘，將100×SA-HRP溶液于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×SA-HRP稀釋成1×SA-HRP工作液，根據(jù)所需用量配置。

備注：如待測樣本中OCLN濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，請根據(jù)實際情況選擇適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。

結(jié)果的計算

計算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(作圖時去掉空白組的值)?；蛘呤褂媚軌蛏伤膮?shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計算機(jī)軟件來創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

示例數(shù)據(jù)

以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗數(shù)據(jù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/mL)	20	10	5	2.5	1.25	0.625	0.313	0
OD值	2.404	1.782	0.956	0.688	0.474	0.238	0.135	0.076
校正OD值	2.328	1.706	0.88	0.612	0.398	0.162	0.059	0

下圖所示標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供示例，結(jié)果計算應(yīng)以同次試驗標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線為準(zhǔn)計算樣本結(jié)果

重復(fù)性

板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于10%。

靈敏度

經(jīng)樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為0.16ng/mL。

特異性

該試劑盒測定可識別重組小鼠OCLN。

其他相關(guān)蛋白在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL，并測定交叉反應(yīng)性。沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)。
使用ELISA試劑盒之前，請您必須完整閱讀說明書，本產(chǎn)品僅供科研使用，不能于臨床診斷或治療。

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