產品及特點：
乙型肝炎病毒（HBV）共價閉合環狀 DNA（covalently closed circμLar DNA，cccDNA）是乙肝病毒前基因組 RNA 復制的原始模板，雖含量較少，每個肝細胞內只有約 5-50 個拷貝，但對乙肝病毒的復制以及感染狀態的建立具有十分重要的意義，只有清除了 cccDNA，才能徹底消除乙肝病毒攜帶狀態。因此靈敏快捷的診斷產品具有重要的意義。本公司產品開發鴨乙型肝炎病毒 cccDNA 染料法熒光定量 PCR 試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。
2. 根據鴨乙型肝炎病毒cccDNA 保守序列設計的專一性引物，與相關病毒無交叉反應。
3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應。
4. 一管式熒光定量 PCR 檢測，避免后續污染。
5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應體系的熒光定量 PCR。
規格及成分：
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編號
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成分
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規格
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試劑一
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2×qPCR MagicMix
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500 μL（棕色管）
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試劑二
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熒光 PCR 專用模板稀釋液
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1 mL（黃蓋）
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試劑三
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鴨乙型肝炎病毒cccDNA 染料法PCR 引物混合液
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100 μL（白蓋）
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試劑四
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鴨乙型肝炎病毒cccDNA 染料法PCR 陽性對
照(1×10E8 /μL)
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50 μL（紅蓋）
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試劑五
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DNA 病毒裂解液（試用裝）
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15 次（9 mL）
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使用手冊
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1 份
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運輸及保存：
低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。
自備試劑：
DNA 模板、10×ROX（根據機型決定，具體見使用方法）。
使用方法：
一、稀釋PCR陽性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6 個 10倍稀釋度為例）：
1. 注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽性對照。
2. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭，下同）。
4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備：
8. 如果有 N 個樣品，必須設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 上步制備的 PCR 陽性對照的第 4號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當于 1 萬拷貝）或第 5 號（濃度為 1×10E5拷貝/μL，10μL 相當于 10 萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。如果每次制備需要 200μL 樣品，則 PC 和 NC 的體積也必須是 200μL。
9. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒 DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒 DNAout。本試劑盒免費贈送 15 次一管式病毒 DNAout。
三、設置 qPCR 反應（20 μL 體系，在樣品制備室進行）：
10. 如果只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于 PCR 陽性對照。如果做 2-3 次重復，則反應設置數量相應增加 2 或 3 倍。
11. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加）：
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成分
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樣品管 N+2 個
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PCR陰性對照管
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PCR陽性對照管2-7 管
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2×qPCR MagicMix （棕色管）
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10μL
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10 μL
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各 10 μL
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鴨乙型肝炎病毒cccDNA
PCR 引物混合液（白蓋）
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2 μL
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2 μL
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各2 μL
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自備 10×ROX (見注)
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2 μL
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2 μL
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各 2 μL
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N+2 待測樣品 DNA 模板
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6 μL
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不加
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不加
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第7步所得PCR陽性對照稀釋液2-7 號
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不加
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不加
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各6μL2號樣到2號管3號樣到3號管…
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注: 僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照，其他熒光 PCR 儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，則用水替代。
12.蓋上蓋子后上機，按下面參數進行PCR（具體PCR參數可以根據儀器不同而自行優化）。
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過程
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溫度
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時間
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預變性
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92℃
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5分鐘
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PCR反應30個循環
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94℃
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60秒
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50℃
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60秒
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72℃
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60秒
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13. 數據采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產品中所含的熒光染料在不結合 DNA 時，最大吸收光譜在 471 nm，結合 DNA 時的最大吸收光譜在 500 nm，最大發射光譜在 530 nm。信號采集可以設置在復性或延伸步驟。
四、數據處理：
14. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的log 值，再推算出其濃度。
15. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。
五、特別提示：
本公司的所有產品，僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！
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