壞死梭桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒

產品及特點：

壞死梭桿菌(Fusobacterium necrophorum )是一種嚴格厭氧的革蘭陰性多形態桿菌，其致病因子包括內毒素、白細胞毒素、血小板凝集因子、血凝素和溶血素等，其中主要的致病因子是白細胞毒素。廣泛存在于與動物活動相關聯的沼澤、污泥、垃圾等處。鹿、羊等反芻動物感染壞死梭桿菌時表現為跛行，關節腫大，肝膿腫和腐蹄病，豬、馬等動物感染壞死梭桿菌時主要表現為跛行，嚴重時繼發其他細菌感染，對養殖業造成巨大損失﹔人類感染該細菌時表現為急性咽炎綜合征(Lemierre's syndrome)。因此快速檢測壞死梭桿菌具有重要意義。

本產品就是以探針法熒光定量 PCR 技術為基礎開發的專門檢測壞死梭桿菌的試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 引物和探針經過優化，靈敏性高。

3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據壞死梭桿菌高度保守區設計，不會跟其他病毒 DNA發生交叉反應。

5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。

規格及成分：

編號	成分	規格
試劑一	2×Probe qPCR MagicMix	500μL（本色蓋）
試劑三	熒光PCR專用模板稀釋液	1mL（黃蓋）
試劑二	壞死梭桿菌qPCR引物混合液	100μL（白蓋）
試劑四	壞死梭桿菌qPCR探針	50μL（棕色管）
試劑五	壞死梭桿菌PCR陽性對照(1×10E8/μL)	50μL（紅蓋）
	使用手冊	1份

運輸及保存：

低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

自備試劑：

樣品DNA。

使用方法：

一、稀釋標準曲線樣品(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例)：

由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。

1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。

6. 放冰上待用。重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備：

7. 如果有 N 個樣品，最好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數 DNA 提取試劑盒兼容。

三、Probe qPCR反應(20μL體系，在樣品制備室進行)：

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

成份	N+2個樣品管	PCR陰性對照管	標準曲線樣品管2-7管
2×Probe qPCR MagicMix	10μL	10μL	各10μL
壞死梭桿菌qPCR探針	1μL	1μL	各1μL
壞死梭桿菌型探針法qPCR引物混合液	2μL	2μL	各2μL
N+2個待測DNA模板	7μL	--	--
超純水	--	7μL	--
第7步所得標準曲線樣品稀釋液2-7號	--	--	各7μL2號樣到2號管,3號樣到3號管

11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行PCR：

過程	溫度	時間
預變性	95℃	3 min
PCR反應40個循環	95℃	15 sec
PCR反應40個循環	60℃	1 min(采集FAM通道的熒光信號)

四、數據處理：

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。若重復結果 Ct值小于 40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。

五、特別提示：

本公司的所有產品，僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

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