肺孢子蟲通用染料法熒光定量PCR試劑盒

產品及特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。

2. 根據肺孢子蟲通用保守序列設計的專一性引物，與相關病毒無交叉反應。

3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應。

4. 一管式熒光定量 PCR 檢測，避免后續污染。

5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應體系的熒光定量 PCR。

規格及成分：

編號	成分	規格
試劑一	2×qPCR MagicMix	500 μL（棕色管）
試劑二	熒光 PCR 專用模板稀釋液	1 mL（黃蓋）
試劑三	肺孢子蟲通用染料法PCR 引物混合液	100 μL（白蓋）
試劑四	肺孢子蟲通用染料法PCR 陽性對照(1×10E8 /μL)	50 μL（紅蓋）
試劑五	DNA 病毒裂解液（試用裝）	15 次（9 mL）
	使用手冊	1 份

運輸及保存：

低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。

自備試劑：

DNA模板、10×ROX(根據機型決定，具體見使用方法)。

使用方法：

一、稀釋PCR陽性對照(以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例)：

1. 注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽性對照。

2. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭，下同）。

4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

6. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

7. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備：

8. 如果有 N 個樣品，必須設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 上步制備的 PCR 陽性對照的第 4號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當于 1 萬拷貝）或第 5 號（濃度為 1×10E5拷貝/μL，10μL 相當于 10 萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。如果每次制備需要 200μL 樣品，則 PC 和 NC 的體積也必須是 200μL。

9. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒 DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒 DNAout。本試劑盒免費贈送 15 次一管式病毒DNAout。

三、設置qPCR反應(20μL體系，在樣品制備室進行)：

10. 如果只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于 PCR 陽性對照。如果做 2-3 次重復，則反應設置數量相應增加 2 或 3 倍。

11. 在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加)：

成分	樣品管 N+2個	PCR陰性對照管	PCR陽性對照管(2-7管)
2×qPCR MagicMix(棕色管)	10μL	10μL	各10μL
肺孢子蟲通用PCR引物混合液(白蓋）	2μL	2μL	各2μL
自備10×ROX(見注)	2μL	2μL	各2μL
N+2待測樣品DNA模板	6μL	不加	不加
第7步所得PCR陽性對照稀釋液(2-7號)	不加	不加	各6μL2號樣到2號管,3號樣到3號管

注: 僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照，其他熒光 PCR 儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，則用水替代。

12.蓋上蓋子后上機，按下面參數進行PCR(具體PCR參數可以根據儀器不同而自行優化)。

過程	溫度	時間
預變性	92℃	5分鐘
PCR反應30個循環	94℃	60秒
	50℃	60秒
	72℃	60秒

13.數據采集

具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產品中所含的熒光染料在不結合DNA時，最大吸收光譜在471nm，結合DNA時的最大吸收光譜在500nm，最大發射光譜在530nm。信號采集可以設置在復性或延伸步驟。

四、數據處理：

14. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。

15. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。

五、特別提示：

本公司的所有產品，僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

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