簡介

纖連蛋白(FN)是細胞外基質的一種高分子量（約500-600 kDa）糖蛋白，與稱為整合素的跨膜受體蛋白結合，纖連蛋白還與其他細胞外基質蛋白結合，如膠原蛋白、纖維蛋白和硫酸肝素蛋白多糖，纖連蛋白以蛋白二聚體的形式存在，由兩條幾乎相同的多肽鏈組成，通過一對C端二硫鍵連接，每個纖連蛋白亞單位的氨基酸分子量為~230-~275 kDa，包含三種類型的模塊：I型、II型和III型，所有這三種模塊都是由兩個反平行的β-片組成，形成一個Beta-三明治；然而，I型和II型是由鏈內二硫鍵穩定的，而III型模塊不包含任何二硫鍵，III型模塊中沒有二硫鍵，這使得它們在受力時可以部分展開。

檢測原理

本試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術:將捕獲抗體包被于酶標板上，捕獲樣品及標準品中的待測物FN，清洗后，再加入生物素標記的檢測抗體進行孵育后清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測抗體”免疫復合物，隨后加入鏈霉親和素偶聯的辣根過氧化物酶進行孵育，待孵育結束后清洗，接著加入TMB顯色后，若樣本中有待測物則顯藍色，加入終止液停止反應。檢測過程中游離的成分均被洗去，用酶標儀在450 nm處測OD值，顏色的深淺和樣品中的待測物的含量呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣本中FN的濃度。

需要的其他材料

1. 酶標儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳；

2. 移液器及槍頭；

3. 蒸餾水或去離子水；

4. 100-1000 mL刻度量筒；

5. 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機；

6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；

7. 用于稀釋標準品和樣品的試管。

樣品保存

樣品收集后若在 1 周內進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內檢測），或-80℃（6個月內檢測），避免反復凍融，標本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

試劑準備工作

使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。

洗滌液/稀釋液配置

如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）

標準品配置

試劑盒中取出標準品，準備7個試管，先從200ng/mL標準品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至10ng/mL（例：50μL的標準品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的10ng/mL濃度標準品），隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將10ng/mL標準品依次2倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的標準品，依次為: 10ng/mL、 5ng/mL、 2.5ng/mL、 1.25ng/mL、 0.625ng/mL、 0.313ng/mL、 0.157ng/mL，從最高濃度標準品溶液中吸取500μL標準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標準品(0ng/mL)。

抗體工作液配置

使用前10分鐘，將100×生物素化抗體于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×生物素化抗體稀釋成1×生物素化抗體工作液，根據所需用量當日配置當日使用。

酶結合物工作液配置

使用前10分鐘，將100×SA-HRP溶液于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×SA-HRP稀釋成1×SA-HRP工作液，根據所需用量配置。

備注：如待測樣本中FN濃度高于標準品最高值，請根據實際情況選擇適當的稀釋倍數。

結果的計算

計算標準品和樣本復孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出四參數邏輯函數的標準曲線(作圖時去掉空白組的值)?；蛘呤褂媚軌蛏伤膮颠壿嫞?-P）曲線擬合的計算機軟件來創建標準曲線。

若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數。

示例數據

以下數據和曲線僅供參考，實驗者需根據自己的實驗數據建立標準曲線。

標準品濃度(ng/mL)

10

5

2.5

1.25

0.625

0.313

0.157

0

OD值

2.487

1.698

0.917

0.669

0.46

0.287

0.129

0.065

校正OD值

2.422

1.633

0.852

0.604

0.395

0.222

0.064

0

下圖所示標準曲線僅供示例，結果計算應以同次試驗標準品所繪標準曲線為準計算樣本結果

重復性

板內變異系數小于10%，板間變異系數小于10%。

靈敏度

經樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為0.08ng/mL。

特異性

該試劑盒測定可識別重組人FN。

其他相關蛋白在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL，并測定交叉反應性。沒有觀察到明顯的交叉反應。

使用ELISA試劑盒之前，請您必須完整閱讀說明書，本產品僅供科研使用，不能于臨床診斷或治療。

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標準品濃度(ng/mL)	10	5	2.5	1.25	0.625	0.313	0.157	0
OD值	2.487	1.698	0.917	0.669	0.46	0.287	0.129	0.065
校正OD值	2.422	1.633	0.852	0.604	0.395	0.222	0.064	0