產(chǎn)品及特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據(jù)犬呼吸道冠狀病毒病毒高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他病毒的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應(yīng)。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研。

規(guī)格及成分：

編號	成分	規(guī)格
試劑一	探針法 qRT-PCR 緩沖液	500 μL（藍(lán)蓋）
試劑二	探針法 qRT-PCR 酶混合液	100 μL（紅蓋）
試劑三	熒光 PCR 專用模板稀釋液	1 mL（黃蓋）
試劑四	犬呼吸道冠狀病毒病毒探針法qRT-PCR引物混合液	100 μL（白蓋）
試劑五	犬呼吸道冠狀病毒病毒 qRT-PCR 探針	50 μL（棕色管）
試劑六	犬呼吸道冠狀病毒病毒探針法qRT-PCR陽性對照 (1×10E8 /μL)	50 μL（黃蓋）
使用手冊		1 份

運輸及保存：

低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。

自備試劑：

樣品 RNA。

使用方法：

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）：

由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。

1. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 RNA 的制備：

7. 如果有 N 個樣品，最好設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的柱式病毒 RNAout。

三、Probe qRT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進行）：

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個 PCR管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

成份	樣品管N+2個	RT-PCR陰性對照管	標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管2-7管
探針法 qRT-PCR 緩沖液	各 10 μL	10 μL	各 10 μL
探針法 qRT-PCR 酶混合液	各 2 μL	2 μL	各 2 μL
犬呼吸道冠狀病毒病毒 qRT-PCR 探針	各 1 μL	1 μL	各 1 μL
犬呼吸道冠狀病毒病毒探針 qRT-PCR引物混合液	各 2 μL	2 μL	各 2 μL
待測樣品 RNA 模板	各 5 μL	--	--
超純水	--	5 μL	--
第7步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液2-7號	不加	不加	各5 μL (2號樣到2號管，3號樣到3號管)

11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 qRT-PCR：

過程	溫度	時間
逆轉(zhuǎn)錄	50℃	30 min
預(yù)變性	94℃	10 min
qRT-PCR反應(yīng)35個循環(huán)	94℃	15 sec
qRT-PCR反應(yīng)35個循環(huán)	60℃	1 min，(采集FAM通道的熒光信號)

四、數(shù)據(jù)處理：

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的 Ct值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。

五、特別提示：

本公司的所有產(chǎn)品，僅可用于科研實驗，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

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