產品及特點：

馬流感(Equine influenza,EI)是由馬流感病毒(Equine Influenza Virus)引起馬的一種急性高度接觸傳染性、群發性呼吸道疾病,類似于人流感,典型的臨床癥狀為突發高熱、咳嗽、呼吸困難、食欲減退。馬流感病毒(Equine influenzavirus,EIV)屬正粘病毒科 A 型流感病毒,H3N8 每年都有發生。潛伏期為 2～10 天，多在經感染 3～4 天后發病。所有病馬在發熱時都呈現全身癥狀。病馬呼吸、脈搏頻數，食欲降低，降神委頓，眼結膜充血水腫，大量流淚。由 H3N8 亞型所致的疾病例能觀察到細支氣管炎或擴散而呈支氣管炎、肺炎和肺水腫。因此快速靈敏診斷具有重要意義。本產品就是以探針法熒光定量 RT-PCR 技術為基礎開發的專門檢測馬流感病毒 H3N8 亞型的試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。

2. 引物和探針經過優化，靈敏性高。

3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據馬流感病毒H3N8亞型高度保守區設計，不會跟其他病毒的RNA發生交叉反應。

5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應。

6. 本產品只能用于科研。

規格及成分：

編號	成分	規格
試劑一	探針法 qRT-PCR 緩沖液	500 μL(藍蓋)
試劑二	探針法 qRT-PCR 酶混合液	100 μL(紅蓋)
試劑三	熒光 PCR 專用模板稀釋液	1 mL(黃蓋)
試劑四	馬流感病毒H3N8亞型探針法qRT-PCR引物混合液	100 μL(白蓋)
試劑五	馬流感病毒H3N8亞型 qRT-PCR 探針	50 μL(棕色管)
試劑六	馬流感病毒H3N8亞型探針法qRT-PCR陽性對照 (1×10E8/μL)	50 μL(黃蓋)
使用手冊		1 份

運輸及保存：

低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。

自備試劑：

樣品 RNA。

使用方法：

一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）：

由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。

1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同)。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 RNA 的制備：

7. 如果有 N 個樣品，最好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒 RNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的柱式病毒 RNAout。

三、Probe qRT-PCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）：

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

成份	樣品管N+2個	RT-PCR陰性對照管	標準曲線樣品管2-7管
探針法 qRT-PCR 緩沖液	各 10 μL	10 μL	各 10 μL
探針法 qRT-PCR 酶混合液	各 2 μL	2 μL	各 2 μL
馬流感病毒H3N8亞型 qRT-PCR 探針	各 1 μL	1 μL	各 1 μL
馬流感病毒H3N8亞型探針 qRT-PCR引物混合液	各 2 μL	2 μL	各 2 μL
待測樣品 RNA 模板	各 5 μL	--	--
超純水	--	5 μL	--
第7步所得標準曲線樣品稀釋液2-7號	不加	不加	各5 μL (2號樣到2號管，3號樣到3號管)

11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 qRT-PCR：

過程	溫度	時間
逆轉錄	50℃	30 min
預變性	94℃	10 min
qRT-PCR反應35個循環	94℃	15 sec
qRT-PCR反應35個循環	60℃	1 min，(采集FAM通道的熒光信號)

四、數據處理：

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。

五、特別提示：

本公司的所有產品，僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

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