產(chǎn)品及特點(diǎn)：
卡氏肺孢子蟲（Pneumocystis carinii）簡稱肺孢子蟲，廣泛存在于人和其他哺乳動(dòng)物的肺組織內(nèi)，可引起肺孢子蟲性肺炎，或稱肺孢子蟲病。卡氏肺孢子蟲為一種威脅人類健康的機(jī)會(huì)致病寄生蟲。卡氏肺孢子蟲寄生于鼠、犬、豬、羊、兔等和人的肺上皮細(xì)胞中引起的寄生蟲病。本公司開發(fā)卡氏肺孢子蟲染料法熒光定量 PCR 試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。
2. 根據(jù)卡氏肺孢子蟲保守序列設(shè)計(jì)的專一性引物，與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng)。
3. 靈敏度可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng)。
4. 一管式熒光定量 PCR 檢測(cè)，避免后續(xù)污染。
5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。
規(guī)格及成分：
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編號(hào)
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成分
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規(guī)格
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試劑一
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2×qPCR MagicMix
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500 μL(棕色管)
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試劑二
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熒光 PCR 專用模板稀釋液
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1 mL(黃蓋)
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試劑三
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卡氏肺孢子蟲染料法PCR 引物混合液
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100 μL(白蓋)
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試劑四
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卡氏肺孢子蟲染料法PCR 陽性對(duì)照(1×10E8 /μL)
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50 μL(紅蓋)
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試劑五
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DNA 病毒裂解液(試用裝)
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15 次(9 mL)
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使用手冊(cè)
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1 份
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運(yùn)輸及保存：
低溫運(yùn)輸、-20℃保存，有效期一年。
自備試劑：
DNA模板、10×ROX(根據(jù)機(jī)型決定，具體見使用方法)。
使用方法：
一、稀釋PCR陽性對(duì)照(以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例)：
1. 注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽性對(duì)照。
2. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭，下同）。
4. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。
6. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照到 5 號(hào)管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備：
8. 如果有 N 個(gè)樣品，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用 10μL 上步制備的 PCR 陽性對(duì)照的第 4號(hào)（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝）或第 5 號(hào)（濃度為 1×10E5拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 10 萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。如果每次制備需要 200μL 樣品，則 PC 和 NC 的體積也必須是 200μL。
9. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級(jí)版柱式病毒 DNAout。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送 15 次一管式病毒DNAout。
三、設(shè)置qPCR反應(yīng)(20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行)：
10. 如果只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照，6 個(gè)用于 PCR 陽性對(duì)照。如果做 2-3 次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加 2 或 3 倍。
11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加)：
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成分
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樣品管 N+2個(gè)
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PCR陰性對(duì)照管
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PCR陽性對(duì)照管(2-7管)
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2×qPCR MagicMix(棕色管)
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10μL
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10μL
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各10μL
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卡氏肺孢子蟲PCR引物混合液(白蓋）
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2μL
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2μL
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各2μL
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自備10×ROX(見注)
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2μL
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2μL
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各2μL
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N+2待測(cè)樣品DNA模板
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6μL
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不加
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不加
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第7步所得PCR陽性對(duì)照稀釋液(2-7號(hào))
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不加
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不加
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各6μL2號(hào)樣到2號(hào)管,3號(hào)樣到3號(hào)管
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注: 僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對(duì)照，其他熒光 PCR 儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，則用水替代。
12.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR(具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化)。
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過程
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溫度
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時(shí)間
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預(yù)變性
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92℃
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5分鐘
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PCR反應(yīng)30個(gè)循環(huán)
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94℃
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60秒
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50℃
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60秒
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72℃
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60秒
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13.數(shù)據(jù)采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合DNA時(shí)，最大吸收光譜在471nm，結(jié)合DNA時(shí)的最大吸收光譜在500nm，最大發(fā)射光譜在530nm。信號(hào)采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟。
四、數(shù)據(jù)處理：
14.如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
15. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。
五、特別提示：
本公司的所有產(chǎn)品，僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！
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