產品及特點：
副結核分枝桿菌（Mycobacterium paratuberculosis）是一種放線菌，短粗桿菌，長 1—2 微米，染色均勻，但偶爾較長的類型表現染色和不染色的節段相交替。在牛和羊上產生“約翰病”。在山羊上實驗產生相似的疾病。豚鼠、家兔、大鼠和小鼠不發病。很大的劑量在實驗室動物上產生輕度結節局部病變，與草分枝桿菌所引起者相類似。本公司開發副結核分枝桿菌染料法熒光定量 PCR 試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。
2. 根據副結核分枝桿菌保守序列設計的專一性引物，與相關病毒無交叉反應。
3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應。
4. 一管式熒光定量 PCR 檢測，避免后續污染。
5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應體系的熒光定量 PCR。
規格及成分：
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編號
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成分
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規格
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試劑一
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2×qPCR MagicMix
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500 μL（棕色管）
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試劑二
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熒光 PCR 專用模板稀釋液
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1 mL（黃蓋）
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試劑三
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副結核分枝桿菌染料法PCR 引物混合液
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100 μL（白蓋）
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試劑四
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副結核分枝桿菌染料法PCR 陽性對照(1×10E8 /μL)
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50 μL（紅蓋）
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試劑五
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DNA 病毒裂解液（試用裝）
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15 次（9 mL）
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使用手冊
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1 份
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運輸及保存：
低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。
自備試劑：
DNA模板、10×ROX(根據機型決定，具體見使用方法)。
使用方法：
一、稀釋PCR陽性對照(以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例)：
1. 注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽性對照。
2. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液(最好用帶芯槍頭，下同)。
4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備：
8. 如果有 N 個樣品，必須設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC(樣品制備陽性對照)，一個是 NC(樣品制備陰性對照)。可以用 10μL 上步制備的 PCR 陽性對照的第 4號(濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當于 1 萬拷貝)或第 5 號(濃度為 1×10E5拷貝/μL，10μL 相當于 10 萬拷貝)再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。如果每次制備需要 200μL 樣品，則 PC 和 NC 的體積也必須是 200μL。
9. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒 DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒 DNAout。本試劑盒免費贈送 15 次一管式病毒DNAout。
PCR反應(20μL體系，在樣品制備室進行)：
10. 如果只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于 PCR 陽性對照。如果做 2-3 次重復，則反應設置數量相應增加 2 或 3 倍。
11. 在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加)：
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成分
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樣品管 N+2個
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PCR陰性對照管
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PCR陽性對照管(2-7管)
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2×qPCR MagicMix(棕色管)
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10μL
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10μL
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各10μL
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副結核分枝桿菌PCR引物混合液(白蓋）
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2μL
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2μL
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各2μL
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自備10×ROX(見注)
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2μL
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2μL
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各2μL
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N+2待測樣品DNA模板
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6μL
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不加
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不加
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第7步所得PCR陽性對照稀釋液(2-7號)
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不加
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不加
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各6μL2號樣到2號管,3號樣到3號管
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注: 僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照，其他熒光 PCR 儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，則用水替代。
12.蓋上蓋子后上機，按下面參數進行PCR(具體PCR參數可以根據儀器不同而自行優化)。
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過程
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溫度
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時間
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預變性
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92℃
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5分鐘
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PCR反應30個循環
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94℃
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60秒
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50℃
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60秒
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72℃
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60秒
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13.數據采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產品中所含的熒光染料在不結合DNA時，最大吸收光譜在471nm，結合DNA時的最大吸收光譜在500nm，最大發射光譜在530nm。信號采集可以設置在復性或延伸步驟。
四、數據處理：
14. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
15. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。
五、特別提示：
本公司的所有產品，僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！
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