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產品及特點：
刺激隱核蟲（Cryptocaryon irritans） 又叫海水小瓜蟲，屬原生動物門、纖毛亞門、寡膜纖毛綱、膜口亞綱、膜口目、凹口科、隱核蟲屬的一種。刺激隱核蟲常寄生于海水硬骨魚類的皮膚、鰓的上皮下，可引起魚類的傳染性疾病。刺激隱核蟲病是海水魚養殖中危害最大的寄生蟲性疾病,又被漁民稱為海水魚白點病。目前,刺激隱核蟲病尚不屬于國家規定的水生動物疫病和人魚共患疾病,但因其傳染性較強,可感染尖吻鱸、紫紅笛鯛、東方鲀、大黃魚、美國紅魚、鱸魚、金鯧、石斑魚、藍子魚、白胡椒鯛、真鯛、黑鯛、平鯛、紅鰭笛鯛等各個品種的海水網箱養殖魚類,危害嚴重時甚至形成暴發性流行的水生動物疫病,特別是魚苗,感染率和死亡率均可達 100%,造成重大的經濟損失，因此刺激隱核蟲的快速檢測具有重要的意義。本產品就是以探針法熒光定量 PCR 技術為基礎開發的專門檢測刺激隱核蟲的通用試劑盒。
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 引物和探針經過優化，靈敏性高。
3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據刺激隱核蟲高度保守區設計，不會跟其他病毒 DNA發生交叉反應。
5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。
規格及成分：
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編號 |
成分 |
規格 |
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試劑一 |
2×Probe qPCR MagicMix |
500μL（本色蓋） |
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試劑三 |
熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL（黃蓋） |
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試劑二 |
刺激隱核蟲探針法qPCR引物混合液 |
100μL（白蓋） |
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試劑四 |
刺激隱核蟲探針法qPCR探針 |
50μL（棕色管） |
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試劑五 |
刺激隱核蟲探針法qPCR陽性對照(1×10E8/μL) |
50μL（紅蓋） |
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使用手冊 |
1份 |
低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。
自備試劑：
樣品DNA。
使用方法：
一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）：
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。
6. 放冰上待用。重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備：
7. 如果有 N 個樣品，最好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數 DNA 提取試劑盒兼容。
三、Probe qPCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行）：
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：
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成份 |
N+2個樣品管 |
PCR陰性對照管 |
標準曲線樣品管2-7管 |
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2×Probe qPCR MagicMix |
10μL |
10μL |
各10μL |
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刺激隱核蟲探針法qPCR探針 |
1μL |
1μL |
各1μL |
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刺激隱核蟲探針法qPCR引物混合液 |
2μL |
2μL |
各2μL |
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N+2個待測DNA模板 |
7μL |
-- |
-- |
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超純水 |
-- |
7μL |
-- |
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第7步所得標準曲線樣品稀釋液2-7號 |
-- |
-- |
各7μL2號樣到2號管,3號樣到3號管 |
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過程 |
溫度 |
時間 |
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預變性 |
95℃ |
3 min |
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PCR反應40個循環 |
95℃ |
15 sec |
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60℃ |
1 min（采集FAM通道的熒光信號） |
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。若重復結果 Ct值小于 40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。
五、特別提示：
本公司的所有產品，僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！
