病毒性神經壞死病病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

產品及特點：

病毒性神經壞死病病毒(Viral Nervous Necrosis Virus，VNNV)是一種RNA病毒，會引起病毒性神經壞死病，流行于除美洲和非洲外幾乎世界所有地區的海水魚類，對仔魚和幼魚危害很大，嚴重者在一周內死亡率可達100%，且近年受感染的魚類種類和受危害程度迅速增加，帶來重大經濟損失，因此快速準確鑒定對該病的預防和檢疫有著重要作用。本產品基于PCR原理開發。

1. 一站式，用于不需要單獨準備每種成分，包括引物和對照。

2. 根據病毒性神經壞死病病毒的保守基因序列設計的引物，具有良好的特異性。

3. 基于染料法 qRT-PCR 檢測，靈敏度比常規 RT-PCR 高 10-100 倍，可以達到至少 1000 拷貝/反應。

4. 使用一管式 qRT-PCR 技術，RT 和 PCR 兩步在一個試管內完成，不需要中間轉移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。

5. 本產品足夠 50 次 30μL 體系的 RT-PCR。

規格及成分：

編號	成分	規格
試劑一	2×qRT-PCR 緩沖液	500 μL（棕色管）
試劑二	10×qRT-PCR 酶混合液	100 μL（紅蓋）
試劑三	ROX 染料 I，50×	20 μL（棕色管）
試劑四	ROX 染料 II，50×	20 μL（棕色管）
試劑五	熒光 PCR 專用模板稀釋液	1mL（黃蓋）
試劑六	病毒性神經壞死病病毒染料法 qRT-PCR 引物混合液	100 μL（白蓋）
試劑七	病毒性神經壞死病病毒染料法 qRT-PCR 陽性對照（1×10E8 /μL）	50 μL（黃蓋）
試劑八	沙核酸釋放劑（試用裝）	20 次（1mL，綠蓋）
試劑九	使用手冊	1 份

運輸及保存：

低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。

陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨放置。本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供 DNA 片段作為陽性對照。

自備試劑：

樣品 RNA。

使用方法：

一、稀釋陽性對照：

以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例，由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原。

1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

2. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

3. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備：

5. 如果有 N 個樣品，必須設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第 4 號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當于 1 萬拷貝）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）。可以用水作為制備的陰性對照。

6. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒 RNA 提取試劑盒兼容。

三、設置RT-PCR 反應（20 μL 體系，在樣品制備室進行）：

7. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號陽性對照稀釋液做模板）。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把 6 個標曲反應縮減成 1 個，其余不變。

8. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后最后加）：

成分	N+2個制備所得樣品	qRT-PCR 陰性對照	qRT-PCR陽性對照(2-7管)
2×qRT-PCR緩沖液	10μL	10μL	各10μL
病毒性神經壞死病病毒染料法qRT-PCR引物混合物	2μL	2μL	各2μL
50×ROX (見注)	0.4μL	0.4μL	各0.4μL
樣品制備所得RNA 模板(來于第8步)	5.6μL	--	--
稀釋所得6個陽性對照 (來于第6步)	--	--	各5.6μL2號樣到2號管,3號樣到3號管
超純水	--	5.6μL	--
10×qRT-PCR酶混合液	2μL	2μL	2μL

注：需使用 ROX 染料 I 的機型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。

需使用 ROX 染料 II 的機型：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的 Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。

不需要使用ROX 的機型：Thermal Cycle Dice Real Time System，LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。

9. 上機后按下面參數進行 RT-PCR（參數可能會因儀器不同而需優化）。

過程	溫度	時間
RT（逆轉錄）	50℃	15-30 min
預變性	95℃	5 min
Qrt-PCR反應40個循環	95℃	15 sec
Qrt-PCR反應40個循環	58℃	1 min,（采集FAM通道的熒光信號）
按儀器預設程序進行溶解曲線分析

四、數據處理：

10. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA濃度的 log 值，再推算出其濃度。

11. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。

五、特別提示：

本公司的所有產品，僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

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